RESULTATEN EN DISCUSSIE
Een A375 melanoom cellijn met een constitutief geactiveerde MAPK als gevolg van een BRAFV600E mutatie werd behandeld met MEK remmer U0126 in een concentratie van 25 uM gedurende 8 uur, wat resulteerde in de onderdrukking van de ERK fosforylering (Fig. 1 a). Immuun-suppressieve oplosbare factor mRNA’s, waaronder IL-6, IL-10, en VEGF, daalden aanzienlijk met de U0126 behandeling (Fig. 1 b), terwijl de controle DMSO behandeling geen invloed had op de productie van IL-10 en VEGF mRNA’s, en slechts een lichte stijging van het niveau van IL-6 mRNA. Een 18 uur durende blootstelling aan U0126 onderdrukte ook de productie van IL-10, VEGF en IL-6 op eiwitniveau, wat aangeeft dat geactiveerde ERK’s verantwoordelijk kunnen zijn voor het onderdrukken van lokale immuunreacties tegen melanoom door de productie van deze immunosuppressieve factoren (Fig. 1 c). Bovendien trad de onderdrukking van ERK fosforylering en de remming van IL-6, IL-10, en VEGF productie op zelfs na het verminderen van de concentratie van de U0126 behandeling tot 10 pM (niet afgebeeld). Tijdens deze studie werden geen significante cytotoxische effecten waargenomen met de U0126 behandeling van de A375 cellen. Hoewel bekend is dat U0126 naast MEK1/2 ook MEK5 remt, werd gefosforyleerd ERK5, het MEK5-substraat, niet gedetecteerd in de A375-cellen (niet afgebeeld), wat erop wijst dat de MEK1/2-ERK1/2-route verantwoordelijk is voor de effecten die worden waargenomen met U0126-behandeling. De onderdrukkende effecten van U0126 op IL-10 en VEGF productie werden ook aangetoond in drie andere melanoom cellijnen met de BRAFV600E mutatie, 624mel, 888mel, en 928mel, zonder enige significante cellulaire toxiciteit (Fig. 1 d). Omdat deze melanoom cellijnen geen IL-6 produceren, lijkt geactiveerde MAPK signalering een algemene rol te spelen bij de productie van immunosuppressieve factoren IL-10 en VEGF in BRAFV600E+ melanoom cellijnen.
Verminderde productie van immuunonderdrukkende oplosbare factoren IL-6, IL-10 en VEGF van melanoomcellijnen met constitutief actieve MAPK door de BRAFV600E-mutatie door remming van de MAPK-signalering met een MEK-remmer, U0126. (a) Remming van fosforylering van ERK1/2 werd gedetecteerd door Western blot analyse van de A375mel melanoom cellijn met de BRAFV600E mutatie voor en 2, 4, 6, en 8 uur na behandeling met MEK remmer U0126 bij een concentratie van 25 uM. (b) Remming van mRNA-expressie voor immuunsuppressieve oplosbare factoren IL-6, IL-10, en VEGF in A375-cellen. De mRNA’s voor verschillende oplosbare factoren, waaronder IL-6, IL-10, en VEGF, werden gemeten door kwantitatieve RT-PCR vóór en 2, 4, 6, en 8 uur na de behandeling met U0126. De controlebehandeling werd uitgevoerd met een DMSO-oplossing. De mRNA-niveaus op elk tijdstip werden genormaliseerd tot GAPDH mRNA en aangegeven als de relatieve waarde ten opzichte van die van 0 uur. (c) Verminderde productie van IL-6, IL-10, en VEGF-eiwitten van A375-cellen na een 18 uur durende behandeling met U0126 bij een concentratie van 25 μM. De expressie werd gedetecteerd door ELISA met de kweeksupernatanten. De verhouding van de levensvatbaarheid van U0126-behandelde cellen DMSO-behandelde cellen bij de oogst was 77%. De cytokineproductie werd genormaliseerd naar de waarde van de met DMSO behandelde controlecellen op basis van het aantal cellen. Western blot toonde sterke remming van ERK fosforylering, maar niet van STAT3 eiwit, of de fosforylering op Ser727 en Tyr705. (d) Verminderde productie van IL-10 en VEGF van drie melanoomcellijnen met de BRAFV600E-mutatie, 624mel, 888mel, en 928mel na een 18-uurs behandeling met U0126 bij een concentratie van 25 μM, die werd gedetecteerd door ELISA met de kweeksupernatanten. De verhoudingen van de levensvatbaarheid van U0126-behandelde cellen DMSO-behandelde cellen bij de oogst waren 95% voor 624mel, 103% voor 888mel, en 100% voor 928mel. De cytokineproductie werd genormaliseerd naar de waarde van de met DMSO behandelde controlecellen op basis van het aantal cellen. Western blot toonde een sterke remming van ERK fosforylering, maar niet van STAT3 eiwit. Een lichte daling van Ser727-fosforylering van STAT3 werd waargenomen in 888mel- en 928mel-cellen, maar niet in 624mel-cellen. Deze resultaten zijn representatief voor drie of vier onafhankelijke experimenten met vergelijkbare resultaten.
Echter kunnen niet-specifieke effecten van U0126 op de cytokineproductie via andere paden dan de MAPK-signalering niet volledig worden uitgesloten op grond van deze experimenten vanwege de waargenomen lichte afname van STAT3-fosforylering op Ser727 in 888mel en 928mel (Fig. 1 d). Om de rol van de geactiveerde MAPK als gevolg van de BRAFV600E mutatie in de productie van IL-10, VEGF, en IL-6 te bevestigen, werd BRAFV600E-specifieke RNAi getransfecteerd in drie melanoom cellijnen, A375, 888mel, en 624mel, met behulp van het lentivirus dat BRAFV600E-specifieke short hairpin RNA (shRNA) (11) tot expressie brengt. De BRAFV600E-specifieke RNAi remde de productie van IL-10, VEGF en IL-6 aanzienlijk en onderdrukte de ERK-fosforylering (Fig. 2). Deze resultaten bevestigen dat de remming van deze factoren door U0126 (Fig. 1) gecorreleerd is met de specifieke remming van de MAPK-route. Deze resultaten zijn consistent met recente artikelen waarin ERK1/2-geïnduceerde IL-10 productie in muriene macrofagen (12) en BRAFV600E-afhankelijke VEGF-productie voor bevordering van angiogenese (13) wordt aangetoond.
Verlaagde productie van immunosuppressieve factoren IL-6, IL-10 en VEGF van drie melanoomcellijnen met de BRAFV600E-mutatie door BRAFV600E-specifieke RNAi. De drie melanoom cellijnen met de BRAFV600E mutatie, A375mel, 888mel, en 624mel, werden geïnfecteerd met de lentivirus vectoren die codeerden voor short hairpin RNA voor ofwel firefly luciferase mRNA (GL3B; als controle) of BRAFV600E mRNA (BRAF#1′) bij 50 of 100 multipliciteit van infectie. Op 5 of 6 d na de infectie, werden eiwitten geëxtraheerd en onderworpen aan Western blot analyse. Een sterke afname van de fosforylering van ERK1/2 met afname van het BRAF eiwit werd waargenomen door de BRAFV600E-specifieke RNAi. Er werd geen significant verschil in STAT3-eiwit en fosforylering van STAT3 op Ser727 of Tyr705 waargenomen. Een lichte afname van fosforylering op Ser727 werd waargenomen in 888mel en 624mel cellen na BRAF RNAi. 5 of 6 d na de lentivirus infectie, werd een gelijk aantal van de melanoom cellen gedoseerd bij een dichtheid van 1-2 × 106 cellen / 2 ml, en de kweeksupernatanten na 18 h werden onderworpen aan ELISA voor IL-6, IL-10, of VEGF. Een sterke afname van IL-6, IL-10 en VEGF werd waargenomen. Een representatief resultaat van twee of drie onafhankelijke experimenten met vergelijkbare resultaten wordt getoond.
Omdat is vastgesteld dat geactiveerde STAT3-signalering resulteert in immuunontwijking van kanker door de productie van verschillende factoren, waaronder VEGF (8, 9), onderzochten wij de relatie tussen de MAPK- en de STAT3-paden met betrekking tot de productie van immuunonderdrukkende factoren in de A375-melanoomcellijn. De productie van IL-6, IL-10, en VEGF werd sterk geremd door RNAi gericht tegen BRAFV600E alleen of STAT3 alleen (Fig. 3 a). Er werd geen duidelijk additief of synergistisch effect waargenomen door tegelijkertijd de BRAF-MAPK en STAT3 pathways te beperken (Fig. 3 a). BRAFV600E RNAi in de A375 cellen verminderde niet de STAT3 DNA-bindende activiteit (Fig. 3 b), de STAT3 promotor activiteit (Fig. 3 c), of STAT3 fosforylering op Ser727 of Tyr705 (Fig. 2), hoewel ERK’s werden gerapporteerd mogelijk in staat te zijn STAT3 op Ser727 te fosforyleren (14). STAT3 fosforylering kan echter ook plaatsvinden door een ERK-onafhankelijke route (15). In 624mel cellen was er weliswaar een lichte afname van Ser727-gefosforyleerde STAT3, maar de DNA-bindende activiteit (Fig. 3 b) en STAT3-promoteractiviteit (Fig. 3 c) werden niet beïnvloed door de BRAFV600E RNAi (Fig. 2). In 888mel cellen was er een vergelijkbare afname van Ser727 fosforylering, maar omgekeerd namen zowel STAT3 DNA-bindende activiteit (Fig. 3 b) als STAT3 promoter activiteit (Fig. 3 c) af na BRAFV600E RNAi (Fig. 2). Deze resultaten suggereren dat de vermindering van de STAT3 transcriptie activiteit niet het belangrijkste mechanisme is dat de immunosuppressieve factor onderdrukking door de down-regulatie van de MAPK signalering in deze melanoom cellijnen genereert.
Remming van IL-6, IL-10, en VEGF productie in A375 cellen door de RNAi voor BRAFV600E alleen, STAT3 alleen, of beide, zonder significante veranderingen in de DNA-bindende en promotor activiteit van STAT3. (a) Grondige remming van IL-6, IL-10, en VEGF-productie in A375 door RNAi voor BRAFV600E alleen, STAT3 alleen, of beide. 5 of 6 d na de infectie, werd een gelijk aantal van de cellen gedoseerd bij een dichtheid van 106 cellen/2 ml, en het kweeksupernatant na 18 h werd onderworpen aan ELISA voor IL-6, VEGF, en IL-10. Afname van BRAF en gefosforyleerd ERK1/2 door de BRAFV600E-specifieke RNAi en afname van STAT3 door de STAT3-specifieke RNAi werden bevestigd door Western blot analyse. Een representatief resultaat van zes onafhankelijke experimenten met vergelijkbare resultaten wordt getoond. (b) Geen significante verandering van de STAT3 DNA-bindende activiteit door remming van MAPK signalering met BRAF RNAi in melanoom cellijnen. STAT3 DNA-bindende activiteit werd onderzocht door EMSA van de kernextracten van melanoom cellijnen met ofwel controle GL3B of BRAF#1′ shRNA vector behandeling. Specifieke STAT3 banden aangegeven door pijlen verdwenen met koude wild-type STAT3 DNA probe (wt), maar niet met mutant STAT3 DNA probe (mt). Slechts een lichte afname van STAT3 DNA-bindende activiteit werd waargenomen in 888mel cellen. (c) STAT3-reportertests in A375-, 624mel- en 888mel-cellen. 2-4 × 105 cellen met ofwel controle of BRAF # 1 ‘shRNA vector infectie werden getransfecteerd met 0,4 ug pSTAT3-TA-Luc en 0,4 ug pRL-SV40 met Effectene Transfection Reagent. 24 uur na de transfectie, werden de cellen geoogst en geanalyseerd voor vuurvlieg en renilla luciferase activiteit. Elke vuurvlieg luciferase activiteit werd genormaliseerd met de renilla luciferase activiteit. Gearceerde balken en foutbalken geven het gemiddelde en de standaardafwijking van de drievoudige assays, respectievelijk. Een representatief experiment van drie of vier onafhankelijke experimenten wordt getoond. STAT3-gedreven transcriptie werd niet veranderd na BRAF RNAi in A375 en 624mel, maar nam licht af in 888mel.
Naar aanleiding van de MAPK- en STAT3-signalering in het supernatant van de A375-culturen werden de mogelijke effecten op de maturatie van DCs onderzocht. Het supernatant van de gekweekte A375 melanoomcellen bevat oplosbare factoren die de maturatie van humane monocyt-afgeleide DC (MoDC) remmen wanneer deze gestimuleerd worden met Toll-like receptor liganden zoals LPS. Toevoeging van de supernatanten van de A375-cultuur aan MoDC-culturen in een eindconcentratie van 10-20% verminderde de productie van ontstekingsbevorderende cytokines, waaronder IL-12 en TNF-α, in MoDC’s aanzienlijk, evenals de CD1a en CD83 celoppervlakmoleculen, maar niet CD80, CD86, CD40, of HLA-DR op MoDC’s. Supernatanten van de andere drie melanoom cellijnen produceerde dezelfde resultaten wanneer toegevoegd aan de MoDC culturen (niet afgebeeld). De onderdrukkende activiteit van de melanoom cel supernatanten afkomstig van de productie van IL-6, IL-10, en VEGF, omdat de toevoeging van specifieke antilichamen voor deze factoren verminderde de onderdrukkende activiteit van de A375 cultuur supernatanten (Fig. 4 a). Verschillen tussen onze waarnemingen en de eerder gerapporteerde resultaten betreffende murine B16 melanoom celsupernatant met een geactiveerde STAT3 die de expressie van MHC klasse II en CD40 remt, kunnen verklaard worden door verschillende tumorcellen of soorten (8).
Verlaagde suppressieve activiteit van de A375 melanoom kweeksupernatanten door voorbehandeling met RNAi voor BRAFV600E alleen, STAT3 alleen, of beide op LPS-geïnduceerde IL-12 en TNF-α productie van DCs. (a) Neutralisatie van IL-6, IL-10, of VEGF in de kweeksupernatanten van A375 melanoomcellen herstelde de remming van IL-12 productie van LPS-gestimuleerde menselijke DCs. Menselijke MoDCs werden gekweekt met de A375 supernatanten in de aan- of afwezigheid van het monoklonale antilichaam voor IL-6, IL-10, VEGF, of een isotype controle antilichaam bij 1 μg/ml. De IL-12 productie in de kweeksupernatanten werd bepaald door ELISA 24 uur na de LPS-stimulatie bij 100 ng/ml. (b) CD14+ monocyten werden geïsoleerd uit PBMC’s met behulp van MACS en gekweekt in de media die RPMI 1640, 10% (vol/v) FBS, 100 ng/ml GM-CSF, en 50 ng/ml IL-4 bevatten, met of zonder 20% (vol/v) van het kweeksupernatant van de A375mel-cellen bereid in Fig. 3. (a) De helft van de media, cytokines, en het kweeksupernatant werd om de 2 d ververst. Op dag 5 van de kweek werd LPS toegevoegd aan 100 ng/ml. Na 15 uur werden de kweeksupernatanten verzameld en onderworpen aan ELISA van IL-12 en TNF-α.
De onderdrukkende activiteit van de A375 kweeksupernatanten op de IL-12 en TNF-α productie van de met LPS behandelde MoDC’s werd hersteld door de A375 cellen vooraf te behandelen met ofwel RNAi gericht tegen BRAFV600E alleen, STAT3 alleen, of zowel BRAFV600E en STAT3 (Fig. 4 b). Hoewel de STAT3 RNAi de onderdrukkende activiteit van de A375 kweeksupernatanten meer leek te verminderen dan de BRAFV600E RNAi, kan het verschil eenvoudigweg worden veroorzaakt door verschillende RNAi activiteiten. Het is echter belangrijk op te merken dat er geen additieve en synergetische effecten werden waargenomen door de RNAi die zich tegelijkertijd richtten op BRAF en STAT3; dit duidt opnieuw op de essentiële rol van beide signaalwegen in de productie van onderdrukkende factoren op DC maturatie. Hoewel activering van DCs door het supernatant van murine CT26 darmkanker cellijn getransfecteerd met een dominant-negatieve vorm van STAT3 mogelijk door de verhoogde productie van proinflammatoire cytokines was gerapporteerd, werd activering van DCs niet waargenomen in deze studie. Dit kan worden verklaard door een onvolledige remming van BRAF en STAT3, geen verhoogde proinflammatoire cytokine productie in de BRAF shRNA-getransfecteerde melanoomcellen, of door verschillen in tumorcellen of species.
Samenvattend hebben wij voor het eerst een essentiële rol aangetoond van de MAPK signalering samen met de STAT3 pathway op de productie van verschillende immunosuppressieve factoren in melanoom cellijnen met constitutief actieve MAPK als gevolg van de veel voorkomende BRAFV600E mutatie. Aldus kan de MAPK-route een potentieel belangrijk moleculair doelwit zijn voor het overwinnen van immuunontwijking van verschillende soorten kanker, omdat het vaak geactiveerd is in verschillende soorten kanker, waaronder melanoom zonder BRAFV600E-mutatie (16, 17).