Mathis begon op 16-jarige leeftijd professioneel te acteren. Haar eerste opdracht was een reclamespot voor “Always Slender Pads – Just For Teens”. Van 1988 tot 1989 speelde ze mee in de televisieseries Aaron’s Way en Knightwatch. Haar eerste hoofdrol in een speelfilm was die van Nora in Pump Up the Volume (1990), tegenover Christian Slater, met wie ze in die tijd een kort afspraakje had. Mathis verfde haar natuurlijke blonde haar zwart voor de rol in een poging om haar imago te veranderen van lief en onschuldig naar wilskrachtig.
Mathis verscheen in de televisiefilms Extreme Close-up, 83 Hours ’til Dawn, en To My Daughter in 1990. Mathis en Slater hadden stemrollen in de tekenfilm FernGully: The Last Rainforest (1992). Daarna was ze te zien in de komedie This Is My Life (1992), geschreven en geregisseerd door Nora Ephron, waarin ze een onzekere tiener speelt. Mathis verscheen in het toneelstuk Fortinbras in New York City in oktober 1992. Super Mario Bros. (1993), waarin ze prinses Daisy uit het populaire Nintendo-videospelletje speelde, was een box-office bom maar kreeg sinds de release een cult-volger.
Mathis ontmoette acteur River Phoenix op de set van The Thing Called Love (1993) en de twee begonnen een relatie. Ze was met Phoenix op 31 oktober 1993, de nacht dat hij stierf in het Cedars-Sinai ziekenhuis aan een overdosis drugs nadat hij in elkaar was gezakt buiten West Hollywood’s Viper Room. Ze maakte de film Jack and Sarah (1995), die werd opgenomen in Londen, om na zijn dood het land uit te zijn vanwege de overmatige persaandacht.
Mathis verscheen in 1994 in de verfilming van Little Women, en in How to Make an American Quilt (1995), beide met Winona Ryder in de hoofdrol. Daarna was ze te zien in The American President (1995), waarin ze de assistente van de president van de Verenigde Staten speelde. Mathis speelde opnieuw met Christian Slater, samen met John Travolta, in John Woo’s Broken Arrow (1996). Ze nam iets meer dan een jaar vrij van acteren nadat haar moeder in 1996 overleed aan borstkanker.
Mathis verscheen later in American Psycho (2000), een verfilming van de gelijknamige roman van Bret Easton Ellis uit 1991. Ze speelde de hoofdrol in Attraction (2000), en in The Simian Line (2001). Ze speelde in de TNT televisie miniserie The Mists of Avalon (2001). Mathis speelde samen met Thomas Jane in The Punisher (2004). Ze had een gastrol in de ABC televisieserie Lost als Olivia Goodspeed. Ze speelde de dochter van Jane Fonda in de Broadway show “33 Variations.” Haar indiefilm Lebanon, PA beleefde zijn wereldpremière op het SXSW Film Festival 2010. Ze verscheen in een off-Broadway productie van het toneelstuk, Love, Loss, and What I Wore, in New York City’s Westside Theatre in oktober 2011.
In 2013 speelde Mathis psychiater Alice Calvert in de CBS televisieserie Under the Dome, gebaseerd op een roman van Stephen King. In 2014 voegde ze zich bij de cast van de FX horror dramaserie The Strain als Justine Feraldo, een New York City raadslid voor Staten Island.
In 2019 verscheen Mathis Off-Broadway in de rol van Kate Conlee in Make Believe, een nieuw toneelstuk van Bess Wohl geënsceneerd in het Second Stage Theater. Michael Greif regisseerde.
Haar musical van 2020, Whisper House, werd uitgesteld vanwege de COVID-19 pandemie.