Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and its management

Kanker is een levensbedreigende ziekte die jaarlijks wereldwijd ongeveer 8 miljoen sterfgevallen veroorzaakt. Slokdarmkanker staat op de zesde plaats op de lijst van meest voorkomende oorzaken van kankergerelateerde sterfte, met een bijdrage van ongeveer een half miljoen sterfgevallen per jaar (GLOBOCAN 2012). Onder de verschillende subtypes van slokdarmkanker is ESCC het overheersende histologische type en komt het veel voor in minder ontwikkelde gebieden, vooral in bepaalde regio’s in Azië en Afrika. Aan ESCC-patiënten wordt een multimodale behandeling aangeboden. Patiënten in een vroeg stadium met resectabele tumoren worden behandeld met voorafgaande tumorresectie, terwijl patiënten in een gevorderd stadium eerst worden behandeld met chemotherapie/chemoradiatie voor tumordownstaging alvorens tot chirurgische resectie wordt overgegaan. Hoewel deze pre-operatieve neoadjuvante behandeling een uitstekende respons kan opleveren in subgroepen van patiënten die gevoelig zijn voor chemotherapie/chemoradiatie, vertoont ongeveer een derde van de patiënten nog steeds slechts een gedeeltelijke en suboptimale respons. Zelfs bij patiënten die reageren op chemotherapie/chemoradiatie kunnen sommigen van hen resistentie ontwikkelen in het latere verloop van de behandelingsperiode. Voor patiënten van wie de tumor niet te verwijderen is, en wanneer de tumor refractair is voor chemotherapie of radiotherapie, is geen effectieve behandeling beschikbaar . Om meer behandelingsmogelijkheden te bieden voor patiënten die niet met de huidige therapieën kunnen worden behandeld, worden nieuwe behandelingsmethoden voorgesteld en in lopende klinische proeven op hun anti-tumor doeltreffendheid geëvalueerd. Zelfs met al deze evoluerende en nieuw opkomende behandelingsmodaliteiten blijft volledige genezing van de ziekte moeilijk. Met het oog hierop zijn nieuwe behandelingen dringend noodzakelijk.

Het gebruik van tumor xenograft diermodellen voor preklinisch onderzoek

Het voornaamste doel van het ontwikkelen van tumor xenograft diermodellen voor onderzoek is een brug te slaan tussen fundamenteel en klinisch onderzoek en het gebruik van in vitro modelsystemen aan te vullen. Tumor xenograft diermodellen bieden een meer verfijnd platform om het proces van tumorigenese in een in vivo omgeving te bestuderen. Dit platform stelt ons in staat een beter inzicht te krijgen in de betrokkenheid van bepaalde oncogenen of tumorsuppressoren bij de ontwikkeling van tumoren door hun verwante signaalwegen en ziektemechanismen bloot te leggen. Bovendien kan het gebruik van deze modellen ons een onderzoeksinstrument verschaffen voor de preklinische evaluatie van de respons van geneesmiddelen door het bepalen van de anti-tumoreffectiviteit naast de toxiciteit van het geneesmiddel, de farmacokinetiek en de farmacodynamiek. Afgezien van de evaluatie van de respons op geneesmiddelen, kunnen deze modellen ook het biomedische beeldvormingsonderzoek vergemakkelijken door een modelsysteem te bieden voor het testen van het nut en de bruikbaarheid van nieuwe tumordetectiemethoden of reagentia.

Muizen zijn de meest gebruikte dieren voor tumor xenograft modellen vanwege een aantal belangrijke voordelige eigenschappen, zoals de aanwezigheid van een vergelijkbare genoomgrootte als de mens, korte voortplantingscyclus, grote worpgrootte, lage onderhoudskosten en gemak van manipulatie . Verschillende muizenstammen met unieke immunodeficiëntie-achtergronden worden gebruikt in kankeronderzoek, en deze omvatten athymische naaktmuizen, SCID-muizen en NOD/SCID-muizen (SCID-muizen met een extra niveau van immunodeficiëntie). Van deze stammen vertonen NOD/SCID-muizen de beste immunodeficiëntie door de afwezigheid van of een defect in bijna alle soorten immuuncellen (B-cellen, T-cellen, dendritische cellen, macrofagen en natuurlijke killercellen), gevolgd door SCID-muizen zonder B-cellen en T-cellen en vervolgens athymische naaktmuizen zonder T-cellen. Vanwege hun verschillende niveaus van immunodeficiëntie worden verschillende stammen in aanmerking genomen voor gebruik voor verschillende onderzoeksdoeleinden. Rekening houdend met de kosten en eigenschappen van verschillende stammen, worden athymische naaktmuizen en SCID-muizen bij voorkeur gebruikt voor het implanteren van menselijke tumorcellijnen, terwijl SCID- en NOD/SCID-muizen eerder worden gebruikt voor de transplantatie van menselijke tumoren.

Gewoonlijk gebruikte tumorxenograft diermodellen voor ESCC-onderzoek

Drie soorten tumorxenograft diermodellen voor ESCC-onderzoek worden ontwikkeld door ESCC-cellen/xenograften of patiëntentumoren in immunodeficiënte dieren te implanteren, namelijk subcutane, orthotope en van de patiënt afgeleide tumorxenograft modellen (Fig. 1). Elk van hen heeft zijn eigen sterke en zwakke punten wat betreft de kenmerken van het model (tabel 1), de oprichtingsmethoden (tabel 2) en de preklinische bruikbaarheid (tabel 3), waardoor ze in een unieke positie verkeren voor onderzoek in een vroeg stadium, een middenstadium of een laat stadium.

Subcutaan tumorxenograftmodel

Subcutaan tumorxenograftmodel is een klassiek diermodel voor ESCC-onderzoek. Dit model wordt vastgesteld door ESCC-cellen/xenograften onder de huid van immunodeficiënte dieren te implanteren om subcutane tumoren te ontwikkelen. De procedure voor de ontwikkeling van subcutane tumoren is technisch eenvoudig, aangezien er alleen naaldinjectie van ESCC-cellen of directe implantatie van ESCC xenograften onder de huid van de dieren nodig is. De groei van subcutane tumoren kan niet-invasief worden gemeten met behulp van een elektronische schuifmaat om de palpabele tumoren te meten. Deze technische procedures van tumorvestiging en -controle kunnen de reproduceerbaarheid en doeltreffendheid (zowel tijd als kosten) van dit model handhaven. Ondanks deze voordelen heeft dit model bepaalde beperkingen, aangezien het de klinische situatie niet volledig weergeeft. Zo gaat dit model bijvoorbeeld gepaard met een verminderde tumorheterogeniteit, aangezien in de meeste scenario’s homogene ESCC cellijnen als bronmateriaal worden gebruikt. Bovendien groeien subcutane tumoren niet in hun eigen tumormicro-omgeving en dit maakt ze niet geschikt voor de studie van tumor-stromale interacties. Met dergelijke sterke en zwakke punten, wordt dit model voornamelijk gebruikt in vroeg stadium onderzoek naar de biologie en het mechanisme van ESCC tumorigenese bestuderen.

Accumulerende rapporten hebben de mijlpaal van de toepassing van subcutane tumor xenograft model voor vroeg stadium onderzoek door het te gebruiken om tumor eigenschappen van ESCC-gerelateerde moleculen en hun bijbehorende ziektemechanismen te bestuderen. Overexpressie van microRNA-340, een microRNA gedownreguleerd in ESCC tumoren, in EC9706 ESCC cellen remde de groei-eigenschappen van deze cellen in een subcutaan tumor xenograft model. Het effect van dit microRNA op ESCC werd gedeeltelijk gemedieerd via zijn effect op een eiwittransferase PSAT1, dat in dezelfde studie werd geïdentificeerd als een direct doelwit van microRNA-340 . In een andere studie werd een snellere groei aangetoond van onderhuidse tumoren die afkomstig waren van KYSE-30 ESCC-cellen met overexpressie van een matrixmetalloproteïnase MMP1, in vergelijking met de controlecellen. Bovendien vertoonden deze MMP1-overexpresserende ESCC-cellen ook een metastatisch potentieel. Het vermogen van MMP1 om tumorprogressie en metastase te bevorderen, bleek toe te schrijven te zijn aan zijn stimulerend effect op een tumorigene pathway waarbij PI3K en AKT betrokken zijn. Een apart rapport maakte ook gebruik van het subcutane tumor xenograft model om cellulair retinoïnezuur bindend eiwit 2 (CRABP2) als tumoronderdrukker aan te tonen door een lagere groeisnelheid aan te tonen van subcutane tumoren afkomstig van EC109 ESCC cellen die CRABP2 overexpresseren in vergelijking met de controle experimentele groep. Deze studies wijzen gezamenlijk op het nut van dit model voor het bestuderen van ESCC-gerelateerde moleculen en hun gerelateerde mechanismen in ESCC.

Naast het gebruik van het subcutane tumor xenograft model voor tumorbiologie studie, zijn pogingen ondernomen om dit model te gebruiken voor het onderzoeken van de anti-tumor effectiviteit van nieuwe behandelingsmethoden of verbindingen / geneesmiddelen voor de behandeling van ESCC. Subcutane tumordragende muizen werden onderworpen aan een behandeling om de expressie van een ESCC-prognostische marker microRNA-375 te induceren en aan het eind van het experiment werd een kleinere tumorgrootte verkregen in vergelijking met het controle-experiment. Naast het routinematige gebruik om nieuwe behandelingsmethoden te onderzoeken, werd dit model ook toegepast om de anti-tumorwerking te onderzoeken van nieuwe verbindingen/drugs voor het tegengaan van ESCC, zoals temsirolimus dat momenteel gebruikt wordt voor niercelcarcinoompatiënten. Naast het nut van dit model voor het testen van de anti-tumoreffectiviteit, kan het ook worden toegepast om de chemo-sensibiliserende effecten van teststoffen te onderzoeken. Behandeling van subcutane tumordragende dieren met ginsenoside Rg3, een ingrediënt geëxtraheerd uit ginseng, leverde het bewijs dat deze verbinding sensibiliserende effecten heeft op twee chemotherapeutische geneesmiddelen paclitaxel en cisplatine die gewoonlijk gebruikt worden voor ESCC-patiënten. Meer recent werd aangetoond dat een nieuwe zuurstofdrager YQ23 selectief chemo-sensibiliserende effecten uitoefent op chemo-resistente subcutane SLMT-1 ESCC xenografts, maar niet op chemo-gevoelige HKESC-2 ESCC xenografts, in behandelingsplannen met cisplatine of 5-fluorouracil, die ook traditionele chemotherapeutische geneesmiddelen zijn die voor ESCC-patiënten worden gebruikt. De bovengenoemde studies waarin de anti-tumoreffectiviteit van testverbindingen/drugs alleen of in combinatie met veelgebruikte chemotherapeutische geneesmiddelen voor ESCC worden onderzocht, hebben het preklinische nut van subcutaan tumorxenograftmodel voor het testen van verbindingen/drugs aangetoond.

Alles bij elkaar genomen zijn subcutane tumorxenograftmodellen, met name die welke goed gekarakteriseerd zijn voor hun gevoeligheid voor chemotherapeutica die momenteel voor ESCC worden gebruikt, waardevolle onderzoeksinstrumenten voor het bestuderen van de tumorbiologie en de ziektemechanismen van ESCC in een in vivo-omgeving en voor het uitvoeren van preklinische studies naar de werkzaamheid tegen tumoren (tabel 3).

Orthotopisch tumorxenograft model

Orthotopisch tumorxenograft model is een alternatief dierlijk kankermodel dat voor ESCC-onderzoek wordt gebruikt. Dit model wordt vastgesteld door ESCC-cellen/xenograften in de slokdarm van immunodeficiënte dieren te implanteren om orthotope tumoren te ontwikkelen. De procedure voor het inplanten van orthotope tumoren is technisch veeleisender in vergelijking met die voor het inplanten van subcutane tumoren, aangezien hiervoor chirurgie bij kleine dieren en/of anesthesie vereist is. Voor het implanteren van ESCC-cellen/xenograften in de slokdarm van dieren worden twee hoofdbenaderingen gevolgd, die verschillen wat betreft de plaats van de tumorimplantatie. Een methode implantaten ESCC cellen / xenografts in de bovenste regio van de slokdarm , terwijl de andere implantaten ESCC cellen / xenografts in het onderste uiteinde van de slokdarm op de buik regio in de buurt van de gastro-oesofageale verbinding . Onlangs hebben we ook gemeld de overleving vergelijking tussen dieren met orthotope tumor ontwikkeld in de bovenste slokdarm regio en de onderste regio, en vond dat die met tumor in de buik regio hebben een betere overleving . Hoewel het meer tijd en arbeidsintensief om orthotope tumoren vast te stellen, kan dit model geschikt voor de studie van tumorgroei in een correcte tumor micro-omgeving als in de klinische situatie en de studie van tumor-stromale interacties mogelijk te maken. Het lijdt echter ook aan dezelfde beperking als het subcutane model door het gebruik van ESCC cellijnen als het bronmateriaal voor tumor vestiging. Een ander belangrijk nadeel van dit model is de noodzaak om gespecialiseerde beeldvormingsmethoden te gebruiken, b.v. het in vivo beeldvormingssysteem gekoppeld aan het gebruik van bioluminescentietechnologie , om de tumorgroei te controleren. Ondanks deze beperkingen, maken de sterke punten van dit model het tot een waardevol diermodel voor gebruik in midden tot laat stadium van onderzoek.

Hoewel het orthotopische tumor xenograft model superieure voordelen biedt in vergelijking met het subcutane model, blijft het gebruik ervan beperkt als gevolg van de hierboven genoemde beperkingen. Ondanks deze tekortkomingen heeft een groeiend aantal rapporten de toepassing van dit model geïllustreerd voor het bestuderen van ESCC tumorigenese en voor het uitvoeren van preklinische anti-tumorigeneciteitstesten. Toen dit model werd gebruikt om het tumoronderdrukkende effect van een transmembraan protease DESC1 aan te tonen, werd een tragere tumorgroei waargenomen bij het gebruik van DESC1-expresserende KYSE-150 ESCC-cellen in vergelijking met die waarbij controlecellen werden gebruikt. In een onafhankelijke studie waarbij dit model werd gebruikt om het tumorfenotype van een tumorgerelateerd proteïne kinase AKT te onderzoeken, werd een duidelijk tumoronderdrukkend effect gevonden in verband met het uitschakelen van AKT, zodat een lagere groeisnelheid van orthotopische tumoren gemakkelijk kon worden vastgesteld. Naast het gebruik van dit model om tumorgroei te bestuderen, kan het ook worden toegepast om het mechanisme van tumorinvasie te onderzoeken. Een uitgebreide studie wees op de betrokkenheid van een celoppervlak molecuul CD44H op tumor invasie gebaseerd op de invasieve patronen waargenomen tussen orthotope tumoren afgeleid van T.T ESCC cellen en de invasieve tegenhanger T.T-1 ESCC cellen. T.T-1 ESCC cellijn drukte een hoog niveau van CD44H uit en was afgeleid van tumorcellen geïsoleerd uit cervicale lymfeklier in een van T.T ESCC cellen afgeleid orthotopisch tumor xenograft model. Dit model wordt niet alleen gebruikt om tumorgroei en -invasie te bestuderen, maar is ook in staat om de effecten van teststoffen op de overleving na de behandeling te beoordelen. Een verlengde overleving werd waargenomen in orthotope ESCC tumor-dragende dieren na behandeling met een mTOR-remmer temsirolimus, waarvoor deze remmer wordt momenteel gebruikt voor niercelcarcinoom .

Generaal, orthotope tumor xenograft model vult het reguliere gebruik van subcutane model voor de studie van ESCC door het verstrekken van een correcte tumor micro-omgeving. Bovendien fungeert dit model als een onmisbaar hulpmiddel bij preklinisch onderzoek voor het onderzoeken van de anti-tumoreffecten van teststoffen/geneesmiddelen (tabel 3).

Patiënt-afgeleide tumor xenograft model

Patiënt-afgeleide tumor xenograft model is een meer geavanceerd dierlijk kankermodel dan de hierboven genoemde modellen voor ESCC-onderzoek. Bij de ontwikkeling van dit model wordt gebruik gemaakt van bij patiënten geresecteerde ESCC-tumoren om tumorxenograften te ontwikkelen in immuundeficiënte dieren. De patiëntentumoren kunnen subcutaan of orthotopisch worden geïmplanteerd. Afhankelijk van de plaats waar de tumor wordt geïmplanteerd, behoudt dit model ook bepaalde kenmerken van de subcutane en orthotope tumorxenograftmodellen. Opmerkelijk is dat tumorxenograften afkomstig van patiëntentumoren dezelfde genetische, histologische en fenotypische eigenschappen hebben als de donortumoren. Aangezien de stromale en celcomponenten van de van patiënten afkomstige tumorxenograften behouden blijven zoals in de donortumoren, kan het gebruik van dit model de nadelen uitsluiten die verbonden zijn aan het gebruik van homogene tumorcellijnen. Ondanks deze voordelen heeft dit model onvermijdelijk te lijden onder verschillende beperkingen. Voor de opstelling van het model moeten tumoren van geresecteerde patiënten worden gebruikt, waarvoor sommige laboratoria voor fundamenteel onderzoek wellicht geen toegang hebben tot deze specimenbron. Bovendien zijn de entingspercentages van de patiënttumoren om tumorxenotransplantaten te vormen suboptimaal en variëren zij afhankelijk van een aantal factoren, zoals tumortypes, tumorimplantatieplaatsen, muizenstammen, tumorkenmerken en patiëntkenmerken. Zelfs voor een patiëntentumor die met succes kan worden geënterd, is een lange latentietijd nodig om uit te groeien tot een tumorxenograft en soms kan dit proces wel 6 maanden duren. Daarom hebben de bovengenoemde beperkingen het tumor vestigingsproces een hoge kosten en arbeidsintensieve procedure gemaakt. Ondanks deze nadelen vervangt dit model geleidelijk andere dierlijke kankermodellen die in midden- en laatstadium van het onderzoek worden gebruikt en is het bijzonder nuttig voor de preklinische evaluatie van de anti-tumoreffectiviteit van nieuwe verbindingen/geneesmiddelen. Inderdaad, dit model wordt soms aangeduid als “klinische proeven in een muis” als gevolg van zijn superieure vermogen om de klinische respons van testverbindingen / geneesmiddelen te voorspellen als gevolg van de grote gelijkenis tussen tumor xenograften en donortumoren.

Gezien alle voors en tegens, kan patiënt-afgeleide tumor xenograft model bieden ons een onderzoeksplatform niet alleen voor het bestuderen van de ziektemechanismen van ESCC, maar kan ook vergemakkelijken preklinische drug screening. Voor deze laatste toepassing wordt dit model bij voorkeur gebruikt boven de subcutane en orthotope modellen wegens de grote klinische relevantie ervan, die het gebruik ervan voor de evaluatie van de anti-tumoreffectiviteit van nieuwe verbindingen/geneesmiddelen ondersteunt. Op dit gebied hebben individuele onderzoeksteams hun eigen collecties van patiënt-afgeleide tumor xenograft modellen met behouden tumor heterogeniteit voor het screenen van geneesmiddelen of geneesmiddelencombinaties voor ESCC (tabel 4).

De patiënt-afgeleide tumor xenograft modellen met goed gekarakteriseerde moleculaire deregulaties die gewoonlijk bij ESCC worden aangetroffen, kunnen worden gebruikt als instrument om momenteel gebruikte geneesmiddelen te testen op hun nieuwe toepassingen bij ESCC. Dit proces is belangrijk omdat het kan leiden tot onderzoek naar nieuwe geneesmiddelen voor patiënten die resistent zijn tegen de huidige behandelingen met geneesmiddelen. Cisplatine en 5-fluorouracil zijn twee chemotherapeutische geneesmiddelen die voor ESCC worden gebruikt, maar niet alle patiënten reageren goed op deze geneesmiddelen. Om een beter inzicht te krijgen in het medicijnmechanisme stelden Zhang et al. een panel samen van van patiënten afkomstige tumor xenograft modellen en karakteriseerden deze voor veel voorkomende genetische afwijkingen die vaak worden aangetroffen in ESCC, zoals HER2 expressie en mutaties van EGFR (epidermale groeifactor receptor), K-ras, B-raf en PIK3CA (fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat 3-kinase katalytische subeenheid alpha). Gebruikmakend van een panel van xenograften met goed gekarakteriseerde HER2- en PIK3CA-status om het behandelingseffect van cisplatine en 5-fluorouracil te onderzoeken, waren tumorxenograften die negatief waren voor HER2 en wild-type PIK3CA droegen gevoeliger voor een dergelijke behandeling in vergelijking met HER2-positieve xenograften, ongeacht de mutatiestatus van PIK3CA . De resultaten van deze studie hebben het verband aangetoond tussen de genetische samenstelling van tumoren en de respons van chemotherapeutische geneesmiddelen.

Naast het gebruik van patiënt-afgeleide tumor xenograft modellen met gedefinieerde genetische samenstelling voor het testen van conventionele chemotherapeutische geneesmiddelen, zijn deze modellen gebruikt om de anti-tumor effectiviteiten te onderzoeken van geneesmiddelen die klinisch niet worden gebruikt voor ESCC, zoals trastuzumab en lapatinib. Bij het testen van het effect van trastuzumab op tumorxenograften die van patiënten zijn afgeleid, bleek dat HER2-positief ESCC gevoelig was voor een dergelijke behandeling, maar niet voor die met een gelijktijdige PIK3CA-mutatie. Verdere behandeling van deze HER2-positieve en PIK3CA-gemuteerde tumorxenograften met de AKT-remmer AZD5363 zorgde er vervolgens voor dat de xenograften weer gevoelig werden voor behandeling met trastuzumab. Een andere studie onderzocht het sensibiliserende effect van lapatinib op de chemotherapeutische middelen oxaliplatine of 5-fluorouracil, met gebruikmaking van een van patiënten afgeleid tumorxenograft-model. Gecombineerde behandeling van lapatinib met 5-fluorouracil leidde tot een krachtiger groeiremmend effect dan lapatinib alleen of de gecombineerde behandeling met oxaliplatin . Deze studies hebben duidelijk het nut aangetoond van deze modellen voor het preklinisch testen van geneesmiddelen. Belangrijk is dat dergelijke tests op tumorxenograften met gedefinieerde genetische achtergronden de ontwikkeling van precisiegeneeskunde kunnen vergemakkelijken door de behandeling met geneesmiddelen te selecteren op basis van de genetische deregulaties van de tumoren.

Patiënt-afgeleide tumorxenograftenmodellen kunnen de genetische diversiteit en samenstelling van de klinische settings nabootsen vanwege de hoge histologische en pathologische relevantie tussen donortumoren en de gevestigde tumorxenograften. Deze vroegere studies hebben de preklinische toepassing van deze modellen voor de evaluatie van de anti-tumor doeltreffendheid van verschillende geneesmiddelen/verbindingen aangetoond (tabel 3). De afgeleide resultaten kunnen ook solide bewijsmateriaal leveren ter ondersteuning van het gebruik van nieuwe geneesmiddelen/verbindingen voor de behandeling van ESCC. Dergelijke preklinische tests vormen derhalve een vitaal platform voorafgaand aan klinische trials.