Het algemene doel van deze procedure is om achtereenvolgens RNA en DNA te extraheren uit archival formaline-ingevulde paraffine-ingebedde weefselkernen. Dit is een protocol voor het oogsten van weefselkernen waaruit we zowel RNA als DNA zullen extraheren. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het verbetert RNA en DNA opbrengst van precies gerichte regio’s in het weefsel block.

Deze procedure is grotendeels ontwikkeld in archival prostaatkanker weefsels. Het kan ook worden toegepast op andere soorten archiefweefsels. De visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als het weefsel coring stappen worden niet vaak gebruikt in onderzoekslaboratoria.

De meeste onderzoekslaboratoria gebruiken in plaats daarvan doorsneden, die weefsels uitputten sneller en voegt aanzienlijke heterogeniteit aan het monster. Begin met het bekijken van de microscoop dia en het schetsen van het gebied van belang met behulp van een fijne punt permanente marker. Snijd vervolgens een deel van de paraffine film groot genoeg om het gebied van belang op de microscoop slide.

Plaats vervolgens de film stevig op het objectglaasje, wikkelen de film over de randen om te voorkomen dat het wegglijden. Met behulp van een fijne punt permanent marker, schets het gehele weefsel en het gebied van belang binnen het weefsel. Vervolgens verwijdert u de film van het glaasje en brengt u deze over naar het bijbehorende weefselblok.

Orienteer de film door deze om te draaien of te draaien, zodat de omtrek van het gehele weefsel overeenkomt met de waargenomen vorm van het weefsel in het blok. Druk de sectie van de film stevig op het oppervlak van het blok om te voorkomen dat verschuiven. Met behulp van de punt van de permanente marker, maak ondiepe maar zichtbare inkepingen langs de omtrek van het gebied van belang en verwijder vervolgens de film.

Next, schoon de receptor punch uit de 0,6 millimeter punch set door onderdompeling van de tip in 1,5 milliliter micro centrifugeerbuis met een milliliter bleekmiddel en schuif de punch op en neer meerdere malen. Herhaal het wassen met het buisje dat 70 % ethanol bevat, en vervolgens met water. Druk nu de gereinigde pons in het interessante gebied tot een diepte van drie millimeter en trek terug.

Verwijder de kern in een weinig bindend micro centrifugeerbuisje door het met de stylus uit de pons te duwen. Voeg een milliliter xyleen aan de microfugebuisjes met de weefselkernen en vortex krachtig gedurende tien seconden. Plaats vervolgens in een warmteblok ingesteld op 50 graden Celsius gedurende drie minuten.

Na de incubatie, centrifugeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur op maximum snelheid. Na het centrifugeren worden de kernen gedurende vijf minuten op ijs gelegd om het wasachtige residu te doen stollen. Verwijder nu voorzichtig de paraffine die zich rond de meniscus heeft opgehoopt samen met het supernatans met behulp van een pipetpunt.

Dan herhaalt u de xyleenbehandeling. Voeg na verwijdering van het paraffine-xyleenmengsel één milliliter 100 % ethanol toe en vortex krachtig gedurende tien seconden. Na centrifugeren op maximale snelheid gedurende twee minuten, zorgvuldig gooi de ethanol.

Herhaal de ethanol wassen nog een keer voordat u begint met de homogenisering. Resuspendeer de gedeparaffineerde kernen in 700 microliter 100 procent ethanol vóór de homogenisatie. Gebruik een gemotoriseerde weefsel homogenisator op een medium instelling om de kernen te malen tot fijne deeltjes.

Grondige homogenisering van het weefsel kernen is vereist voor een optimale DNA en RNA opbrengst. Vervolgens vult u aparte 15 milliliter buisjes met ongeveer tien milliliter bleekmiddel, RNase neutraliserende oplossing, en 70 procent ethanol. Na het homogeniseren van het monster, was de homogenisator sonde in elk van de reinigingsoplossingen in volgorde.

Run de homogenisator op de hoogste snelheid tijdens het wassen fase. Veeg de sonde af met een tissue en laat de sonde volledig drogen alvorens het volgende monster te homogeniseren. Inspecteer de sondebladen visueel op achtergebleven stukjes weefsel en maak de sonde indien aangetroffen opnieuw schoon.

Na het homogeniseren brengt u het monstervolume op één milliliter met 100 procent ethanol en centrifugeert u vervolgens 15 minuten op maximale snelheid. Zuig de ethanol voorzichtig op en laat de pellets ongeveer 15 tot 20 minuten aan de lucht drogen voordat met de proteinase K-extractie wordt begonnen. Resuspendeer de pellets in 150 microliter proteinase K-destructiebuffer en schud de buisjes om de pellet los te maken.

Overnacht proteinase K-destructie wordt aanbevolen voor een hogere DNA-terugwinning. Voeg 10 microliter temperatuurstabiele proteïnase K toe en meng door te schudden. Incubeer 15 minuten bij 56 graden Celsius onder zacht roeren.

Incubeer de buisjes gedurende drie minuten op ijs. Centrifugeer de buisjes na afkoeling 15 minuten op maximale snelheid. Vervolgens, zonder verstoring van de pellets, zorgvuldig over te dragen elk supernatant naar een nieuwe micro centrifugeerbuis voor RNA zuivering.

Extraheer RNA en DNA met behulp van de geoptimaliseerde procedure in het geschreven protocol, dat een verlengde weefsel digestie tijd voor DNA-extractie omvat. RNA en DNA kan worden teruggewonnen uit oudere formaline-vaste paraffine-ingebedde weefselmonsters met behulp van deze methode. Nucleïnezuren werden geëxtraheerd uit prostaatkankermonsters variërend van drie tot 14 jaar in monsterleeftijd.

De gemiddelde opbrengst was 2, 270 nanogrammen RNA en 820 nanogrammen DNA. Interessant is dat er geen significante correlatie was tussen de leeftijd van het weefselmonster en de nucleïnezuurwinning. Over het algemeen waren RNA en DNA-opbrengsten gecorreleerd over monsters, hoewel in de meeste gevallen meer dan twee keer zoveel RNA werd teruggewonnen ten opzichte van DNA.

Om de prestaties van genomisch DNA geëxtraheerd met dit protocol aan te tonen, werden bisulfiet geconverteerde DNA-extracten van archiefprostaatkankermonsters geamplificeerd door methyleringsspecifieke PCR. ALU repetitieve elementen werden gebruikt als een methyleringscontrole en vertoonden weinig variatie tussen monsters. GSTP1, een gen waarvan bekend is dat het hypergemethyleerd is bij prostaatkanker, vertoonde geen detecteerbare amplificatie door methyleringsspecifieke PCR wanneer DNA van goedaardige monsters werd gebruikt.

DNA-monsters van patiënten met agressieve prostaatkanker vertoonden detecteerbare QPCR-cylusdrempelwaarden die lager waren dan die van indolente prostaatkankercellen, wat wijst op verhoogde methylering van GSTP1 bij agressieve prostaatkanker. Wanneer deze techniek eenmaal onder de knie is, kan zij in drie tot vier uur worden uitgevoerd voor RNA en, na een nacht digestie, in vier uur voor DNA, als zij goed wordt uitgevoerd. Deze techniek moet onderzoekers in de moleculaire pathologie in staat stellen om diagnostische DNA- en RNA-biomarkers in een verscheidenheid van kankers te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u weefselkernen kunt voorbereiden voor extractie van DNA en RNA uit nauwkeurig in kaart gebrachte interessegebieden in archiefweefselblokken.