Abstract

De effecten van zink, magnesium en calcium in zaadplasma op time-to-pregnancy (TTP) bij gezonde paren, op conventionele spermaparameters en computer-assisted semen analysis (CASA) parameters werden geëvalueerd. De lokalisatie van chelateerbare zinkionen in het zaadplasma en de spermatozoa werd beoordeeld met behulp van autometallografie (AMG). Verschillen in de lokalisatie van chelateerbaar zink in monsters met veel en weinig totaal zink werden geëvalueerd. Spermamonsters van 25 paren met een korte TTP en 25 paren met een lange TTP werden onderworpen aan conventionele semenanalyse, CASA, zink- en magnesiummetingen met behulp van inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie, en calcium met behulp van vlam-atomaire absorptiespectrometrie. De kationen waren sterk met elkaar gecorreleerd, maar er werd geen correlatie gevonden met TTP of conventionele spermaparameters. Spermamonsters met hoge zinkconcentraties vertoonden statistisch significant slechtere motiliteit, beoordeeld aan de hand van de CASA-parameters straight line velocity en linearity, dan monsters met een laag zinkgehalte. Calciumconcentratie vertoonde ook statistisch significante verschillen voor dezelfde parameters, maar het effect werd verwijderd door zinkconcentratie op te nemen in een meervoudig regressiemodel. Spermamonsters met een hoog totaal zinkgehalte vertoonden een sterkere verkleuring van het seminale plasma bij AMG. Er wordt gesuggereerd dat hoge zinkconcentraties in het zaad een onderdrukkend effect hebben op de progressieve beweeglijkheid van de spermatozoa (kwaliteit van de beweging), maar niet op het percentage beweeglijke spermatozoa (kwantiteit van de beweging).

Inleiding

Het totale zinkgehalte in sperma van zoogdieren is hoog, en zink blijkt van cruciaal belang te zijn voor de spermatogenese. Een zinktekort wordt in verband gebracht met hypogonadisme en onvoldoende ontwikkeling van secundaire geslachtskenmerken bij de mens (Prasad, 1991), en kan bij de rat atrofie van de zaadbuizen en daardoor falen van de spermatogenese veroorzaken (Millar et al., 1958; Underwood, 1977; Endre et al., 1990). Van hoge zinkconcentraties is bekend dat zij de zuurstofopname in de spermacel remmen (Huacuja et al., 1973; Foresta et al., 1990), en de door albumine geïnduceerde acrosoomreactie (Foresta et al., 1990). Kop-staart hechting/loslating en nucleaire chromatine condensatie/decondensatie wordt ook beïnvloed door seminaal zink (Kvist, 1980; Bjorndahl en Kvist, 1982). Er zijn tegenstrijdige rapporten over het effect van seminaal zink op de beweeglijkheid van sperma (Stankovic en Mikac-Devic, 1976; Danscher et al., 1978; Caldamone et al., 1979; Lewis-Jones et al., 1996). Er is aangetoond dat chelatie van zinkionen de beweeglijkheid van spermacellen beïnvloedt (Saito et al., 1967; Danscher and Rebbe, 1974), en er is gesuggereerd dat biobeschikbaar zink gebonden aan vesiculaire hoogmoleculaire gewichtseiwitten in plaats van totaal zink in de zaadcel een maat zou moeten zijn voor het effect van zink op de spermafunctie (Bjorndahl et al., 1991; Carpino et al., 1998).

Deze studie richt zich voornamelijk op zink. Het verband van seminaal zink, en tot op zekere hoogte magnesium en calcium, met de tijd tot aan de zwangerschap (TTP) bij gezonde paren werd geëvalueerd. Bovendien werd de correlatie tussen deze divalente kationen en conventionele sperma parameters en computer-assisted semen analysis (CASA) parameters beoordeeld.

Autometallografie (AMGZn) is een histochemische methode voor de detectie van zinkionen en los gebonden zinkionen (chelateerbaar zink) in weefsel. Verschillen in de lokalisatie van zinkionen op lichtmicroscopisch en elektronenmicroscopisch niveau in de spermatozoa en het zaadplasma van mannen met een hoog totaal zinkgehalte en een laag totaal zinkgehalte werden onderzocht.

Materialen en methoden

Studiepopulatie

Er werden in totaal 430 paren gerekruteerd onder 52 255 leden van vier vakbonden. Van de 430 paren werden spermamonsters verkregen, de motiliteit werd manueel en met CASA (zie later) beoordeeld, en de monsters werden ingevroren (-20°C) bewaard tot verdere analyse. Paren zonder eerdere voortplantingservaring werden ingeschreven wanneer zij stopten met anticonceptie en werden gevolgd gedurende minimaal zes volledige menstruatiecycli of totdat zwangerschap werd herkend. Van de 430 paren werden 50 paren die zwanger werden voor deze studie geselecteerd: de 25 paren met de kortste TTP (S-TTP, mediaan 1 maand, spreiding 1-2 maanden), en de 25 paren met de langste TTP (L-TTP, mediaan 10 maanden, spreiding 7-28 maanden). Spermamonsters van deze 50 paren werden onderworpen aan de onderstaande analyses.

Conventionele semenkenmerken

Spermamonsters werden verkregen door masturbatie in 50 ml steriele polystyreenpotjes na aanbevolen 3 dagen onthouding. Na liquefactie werden de monsters bij kamertemperatuur geanalyseerd volgens de criteria van de Wereldgezondheidsorganisatie (1992).

Hoeveelheid werd gemeten in een gegradueerde Falcon glazen buis van 10 ml (nauwkeurigheid 0,1 ml). Handmatige beweeglijkheidsbepalingen van sperma werden uitgevoerd in een Makler-telkamer (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israël). Elke aangetroffen spermatozoïde werd als volgt gegradeerd: a: snelle progressieve motiliteit, b: trage of trage progressieve motiliteit, c: niet-progressieve motiliteit, d: immotiliteit. Er werden ten minste 2×100 scores uitgevoerd. Indien het verschil tussen twee opeenvolgende tellingen meer dan 10% bedroeg, werden twee nieuwe tellingen verricht. Het percentage beweeglijke spermacellen werd gedefinieerd als groep `a + b + c’. De concentratie werd gemeten in een Makler-telkamer, en de morfologie werd geclassificeerd volgens de “strenge” Tygerberg-criteria beschreven door Kruger et al. (1986) op aan de lucht gedroogde uitstrijkjes gefixeerd in ethanol en ether, gekleurd met de Papanicolaou-techniek (Wereldgezondheidsorganisatie, 1992). De morfologie werd beoordeeld door één enkele, daartoe opgeleide laborant. De levensvatbaarheid van het sperma werd bepaald aan de hand van eosine-negrosine gekleurde uitstrijkjes.

Computerondersteunde sperma-analyse

Materiaal voor CASA werd als volgt verkregen: 4,5 ul verse, goed gemengde spermatozoa werd met een pipet overgebracht naar een Makler-telkamer met een diepte van 10 μm. Het monster werd geplaatst in een Olympus BH-2 fase-contrast microscoop (Olympus Denmark A / S, Glostrup, Denemarken) met een verwarmingsplaat (37 ° C) bij × 200 vergroting. Een Sony videocamera DXC-107 (Sony Corp., Tokyo, Japan) bracht de beelden over naar een Sony PVM-1440QM kleurenvideomonitor (Sony Corp., Tokyo, Japan). De beelden werden opgenomen op een JVC HR-D560EG/E videocassetterecorder (JVC Victor Company of Japan, Tokyo, Japan). De opnamen werden later geanalyseerd op een Hobson Sperm Tracker (Hobson Tracking Systems Ltd, Sheffield, UK) met een opnamefrequentie van 25 Hz, een volgtijd van 2 s (totaal 50 beelden), een gezichtsveld van 300 × 300 μm (waardoor alle rechte lijnsnelheidswaarden tot 150 μm/s kunnen worden gedetecteerd). 100 spermatozoa werden geanalyseerd per monster.

De volgende parameters werden afgeleid van de analyses: kromlijnige snelheid (VCL), rechte lijnsnelheid (VSL), lineariteit (LIN), gemiddelde pad snelheid (VAP), en amplitude van laterale hoofd verplaatsing (ALH).

Bepaling van zink, magnesium, en calcium in sperma

Zink, magnesium, en calcium in het sperma werden gemeten in alle 50 monsters. Zink- en magnesiumconcentraties in sperma werden bepaald met inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICP-MS). Het instrument was een PQ2+ van Fisons Elemental (Winsford, Cheshire, UK). Een aliquot van 20 μl werd 100-voudig verdund met een oplossing die 5 g/l 25% ammonia (ARISTAR; Merck, Poole, UK), 0,5 g/l EDTA (Janssen Chimica, Geel, België), en 0,5 g/l Triton X-100 (Sigma, St Louis, MO, USA) in 18 MW Millipore water bevatte. Als interne standaard werd scandium (AccuStandard, New Haven, CT, USA) toegevoegd tot een eindconcentratie van 100 μg/l. Alle monsters werden in duplo bereid. De kalibratie werd uitgevoerd met blancomonsters waaraan zink en magnesium (AccuStandard) waren toegevoegd tot eindconcentraties van 1, 2 en 3 mg/l, wat overeenkomt met concentraties van 100, 200, en 300 mg/l in de oorspronkelijke spermamonsters. Deze analyse werd uitgevoerd in peak jumping mode met metingen op 24Mg, 66Zn en 45Sc.

De bepaling van calcium werd in dezelfde preparaten uitgevoerd met behulp van vlam-atomaire-absorptiespectrometrie (FAAS). Het instrument was een Perkin-Elmer 306 (Norwalk, CT, USA). De kalibratie werd uitgevoerd voor concentraties die overeenkomen met 100, 200 en 400 mg/l in de oorspronkelijke spermamonsters. Monsters met hoge calciumconcentraties werden driemaal verder verdund om binnen de kalibratiecurve te vallen.

De detectiegrenzen, berekend als driemaal de standaardafwijking voor 10 blancomonsters die bij dezelfde gelegenheid als de monsters waren bereid, waren 1 mg/l voor zink, 3 mg/l voor magnesium, en 2 mg/l voor calcium (uitgedrukt als concentraties in de onverdunde spermamonsters). De totale variatiecoëfficiënten van de bepalingen, zoals berekend uit de resultaten van de duplo-analyses, bedroegen 18% voor zink, 32% voor magnesium, en 17% voor calcium.

Voor tien van de monsters werden ook voorbereidingen getroffen voor de bepaling van zink met vlamatmosferische absorptiespectrometrie (FAAS). Lineaire regressieanalyse van ICP-MS- versus FAAS-resultaten gaf een helling van 0,79 (95%-betrouwbaarheidsinterval: 0,58-1,00), een intercept van 13 μg/l en r2 van 0,90. De iets hogere resultaten voor de ICP-MS analyses waren dus niet statistisch significant.

Autometallografische (AMG) ontwikkeling van sperma-uitstrijkjes voor lichtmicroscopische analyse

Vijf monsters met een hoog (242-308 mg/l) en 5 met een laag (38-57 mg/l) zinkgehalte, zoals bepaald met ICP-MS, werden gedurende 30 min geïncubeerd in 0,5% natriumsulfide (Bie & Berntsen) om zinksulfide-roosters te maken. Er werden uitstrijkjes gemaakt van de ejaculaat/sulfide-oplossing op met Farmer afgespoelde glasplaatjes. De uitstrijkjes werden aan de lucht gedroogd, gedurende 30 min. gefixeerd in 3% glutaaraldehyde (Bie & Berntsen) en 3×2 min. in 0,1 M fosfaatbuffer en eenmaal gedurende 2 min. in gedestilleerd water gelegd.

De uitstrijkjes werden vervolgens met AMG ontwikkeld om de zinksulfide-roosters met zilver te versterken. De ontwikkelaar bestond uit 60 ml gefilterde Arabische gomoplossing (1 kg opgelost in 2 l gedestilleerd water; Bidinger A/S, Aarhus, Denemarken), 10 ml natriumcitraatbuffer en 0,85 g hydrochinon (Merck, Darmstadt, Duitsland) opgelost in 15 ml warm, gedestilleerd water. Onmiddellijk voor gebruik werd 0,11 g zilverlactaat (Fluka, Buchs, Zwitserland) in 15 ml gedestilleerd water toegevoegd en de oplossing werd grondig gemengd.

Gespoelde potjes met de spermasmeerstrijkjes werden in een waterbad van 26°C geplaatst en overgebracht in een lichtdichte doos. De nieuw bereide AMG ontwikkelaar werd in de potjes gegoten, en de uitstrijkjes werden gedurende 30 minuten in de donkere doos ontwikkeld.

Na de ontwikkeling werden de uitstrijkjes gedurende 10 minuten in stromend gedeïoniseerd water gespoeld, gedurende 5 minuten in 5% natriumthiosulfaat geplaatst, gedurende 2 minuten met stromend gedeïoniseerd water gewassen, gedurende 30 minuten met 70% ethanol nagefixeerd, en tenslotte gedurende 2 minuten met stromend gedeïoniseerd water gespoeld. De tegenkleuring werd uitgevoerd met een 0,1% waterige toluïdine blauwe oplossing, pH 4,0 (1 g toluïdine blauw in 1000 ml buffer: 614,5 ml 0,1 M citroenzuur monohydraat en 385,5 ml 0,2 M dinatriumwaterstoffosfaat dihydraat; Merck, Darmstadt, Duitsland). De uitstrijkjes werden geplaatst voor 2 × 2 min in gedestilleerd water, 3 × 3 min in 99% ethanol, 3 × 3 min in xylol, en ten slotte gemonteerd met DEPEX (Merck, Darmstadt, Duitsland).

Preparaties van sperma uitstrijkjes voor elektronenmicroscopische analyse

Smeertjes van sperma monsters werden bereid zoals hierboven beschreven, behalve dat ze niet werden gemonteerd met DEPEX. Na de procedure 0,5% osmiumtetroxide werd toegevoegd gedurende 30 min, en de uitstrijkjes werden geplaatst voor 3 × 2 min in buffer en 1 × 2 min in gedestilleerd water. De osmium-gecontrasteerde uitstrijkjes werden bestudeerd in de lichtmicroscoop, en gebieden van belang voor verdere elektronenmicroscopische analyses werden gemarkeerd met een diamant mes.

De geselecteerde uitstrijkjes werden gedehydrateerd in graded ethanol oplossingen en ingebed in Epon (Bie & Berntsen). Epon blokken geplaatst op de top van de eerder gemarkeerde gebieden van belang werden gehouden bij 60 ° C gedurende 24 uur en vervolgens afgebroken van het glas uitstrijkjes. Er werden halfdunne (3 μm) coupes gesneden en op glasglaasjes geplaatst. Na lichtmicroscopische analyses werden geselecteerde secties opnieuw ingebed in Epon, en ultradunne secties werden gemaakt en tegengekleurd met loodcitraat vóór onderzoek in een JEOL 100S elektronenmicroscoop.

Statistische methoden

Multipele regressieanalyses werden toegepast op de gegevens om de impact van de individuele parameters op het resultaat te detecteren. Spearman’s rangcorrelatiecoëfficiënten werden berekend voor verschillende correlaties. Voor de vergelijking van groepen werd de Wilcoxon rank-sum test voor verschillen in medianen uitgevoerd.

Resultaten

In tabel I worden de zink-, magnesium- en calciumgehalten gepresenteerd, samen met het relatieve aandeel van de kationen in het zaadplasma. Vergelijking van de medianen voor deze parameters in de twee groepen S-TTP versus L-TTP met tweesample t-tests bracht geen statistisch significante verschillen voor een van deze parameters aan het licht. Er werd een sterke positieve intercorrelatie gevonden tussen zink, magnesium en calcium (Spearman’s rangcorrelatiecoëfficiënten waren 0,79-0,86, P < 0,01) (figuur 1).

Geen van beide kationen was nauw gecorreleerd met een van de conventionele semenparameters. Bij het uitvoeren van meervoudige regressieanalyse op alle gegevens kwam alleen het zinkgehalte naar voren met een P-waarde onder 0,05 voor de volgende CASA-parameters: VSL 0,04, en LIN 0,008. Het invoeren van magnesium of calcium in het model gaf geen verbetering van de waarden.

De spermamonsters werden verdeeld in twee groepen van gelijke grootte volgens de kationstatus van elk kation. De volgende scheidingspunten (medianen voor alle 50 monsters) werden vastgesteld: zink 112 mg/l, magnesium 98 mg/l en calcium 476 mg/l. Er werden een aantal statistisch significante verschillen tussen de twee groepen vastgesteld (tabel II). De P-waarden voor de zinkgroepen gaven de grootste verschillen aan, de calciumgroepen hadden intermediaire verschillen, en de magnesiumgroepen vertoonden slechts geringe verschillen (behalve voor LIN).

Voor de relatieve verhouding tussen de kationen (Tabel III) waren de scheidingspunten: zink:magnesium 1,26, en zink: calcium 0,22. De monsters met een zink:calcium verhouding boven 0,22 vertoonden statistisch significant lagere waarden voor de CASA parameters VSL, LIN en STR in vergelijking met de monsters met een verhouding onder 0,22. De correlatie zink:magnesium is 0,86 (Spearman’s rangcorrelatiecoëfficiënt), en voor zink:calcium is dat 0,79. Het zinkgehalte lijkt nauwer samen te hangen met het magnesiumgehalte dan met het calciumgehalte, wat het verschil tussen de groepen zou kunnen verklaren.

Bij de beoordeling van het gehalte aan zinkionen in AMG-preparaten werd op lichtmicroscopisch niveau een verschil waargenomen in monsters met een laag totaal zinkgehalte vergeleken met monsters met een hoog totaal zinkgehalte. Figuur 2 toont verschillen in AMG-kleuring in een monster met 299 mg/l en een monster met 53 mg/l zink in het zaad. De kleuring rond het acrosoom, de staart en in het zaadplasma bleek schaars te zijn in de monsters met een laag totaal zinkgehalte. Deze bevindingen konden niet worden bevestigd op elektronenmicroscopisch niveau (figuur 3A), en er werd met name geen verschil gezien in intracellulaire kleuring van de spermatozoa. Figuren 3B en 4 tonen de lokalisatie van zinkionen in de staart van de spermatozoa. Het wordt overal in de staart aangetroffen, geconcentreerd in de flagellaire accessoire vezels en het membraan. In het zaadplasma werden micrometer-grote lichaampjes gevonden die rijk waren aan zinkionen (figuur 5).

Discussie

Dit is voor zover wij weten de eerste studie die de invloed van zaadzink, magnesium en calcium op TTP en CASA parameters bij gezonde mensen evalueert. Er werd een verband gevonden tussen hoge zinkconcentraties en lage lineariteit van spermabewegingen zoals uitgedrukt door een afname van VAP, VSL, STR en LIN. Magnesium- en calciumconcentraties waren nauw gecorreleerd met zinkconcentratie, maar waren niet zo sterk geassocieerd met de CASA-parameters. De beweeglijke concentratie bleek niet beïnvloed te worden door de totale concentratie van zink, magnesium en calcium. Er werden echter wel verschillen gevonden tussen een hoog en een laag zinkgehalte en enkele CASA-parameters (tabel II). Bij vergelijking van de 25 spermamonsters met het laagste totale zinkgehalte (mediaan 72 mg/l) met de 25 monsters met het hoogste totale zinkgehalte in het sperma (mediaan 187 mg/l) bleek uit de Wilcoxon rank-sum test een statistisch significant verschil in medianen voor VSL (P = 0,004) en LIN (P = 0,001). Voor VAP was het verschil eveneens significant (P = 0,02). Voor VCL werd geen verschil gevonden. Aangezien er geen verschillen waren in het percentage beweeglijke of beweeglijke concentratie in de monsters met een laag en een hoog zinkgehalte, lijkt het er dus op dat een zinkrijke omgeving de spermacellen op een meer willekeurige en minder voorwaartse manier doet bewegen. Het lijkt het aantal beweeglijke zaadcellen niet te verminderen.

VSL drukt uit hoe ver de zaadcel zich recht vooruit beweegt in een bepaalde hoeveelheid tijd, en het is, vanuit klinisch oogpunt, waarschijnlijk de belangrijkste CASA-parameter. In een studie van Moore en Akhondi (1996) over het bevruchtend vermogen van epididymale spermatozoa van ratten bleek een daling van VSL sterk negatief gecorreleerd te zijn met het resultaat van een in vitro bevruchting.

In de loop der jaren is er veel discussie geweest over de rol van zink in het zaadplasma op de functies van sperma. De kop van het sperma accumuleert een veel hogere concentratie dan het zaadplasma, en zink is essentieel voor de stabiliteit van het chromatine en het vermogen van het chromatine om op het juiste moment te decondenseeren (Kvist, 1982; Kvist en Bjorndahl, 1985; Kvist et al., 1987, 1988), en een fysiologische rol voor zink als een bewaarder voor een inherent mechanisme voor kop-staart onthechting is geopperd (Bjorndahl en Kvist, 1982). Er zijn echter tegenstrijdige rapporten over het effect van zink in de zaadcellen op de beweeglijkheid van sperma, en de meeste studies hebben betrekking op kwantitatieve beoordelingen. In een studie van Lewis-Jones e.a. (1996) werden bij 1178 patiënten die een vruchtbaarheidsbehandeling moesten ondergaan, de zink- en fructoseconcentraties in het zaadplasma gemeten, maar voor zink werd geen statistisch significante correlatie met de beweeglijkheid gevonden. Abou-Shakra et al. (1989) hebben met ICP-MS verschillende sporenelementen in het zaadplasma gemeten, maar vonden geen correlatie tussen de zinkconcentratie in het zaad en de dichtheid of beweeglijkheid van het sperma bij normosperme, oligosperme of azoösperme mannelijke dieren. De zinkconcentraties in hun studie waren vergelijkbaar met de niveaus in deze studie. Danscher et al. (1978) hebben hoge zinkconcentraties in verband gebracht met een verminderde beweeglijkheid van de zaadcellen, terwijl anderen een hoog zinkgehalte in het zaadplasma in verband hebben gebracht met een hoge mate van beweeglijkheid van de zaadcellen (Stankovic en Mikac-Devic, 1976; Caldamone et al., 1979).

In deze studie hebben we ons zowel beziggehouden met kwantitatieve bepalingen van het totale zinkgehalte als met kwalitatieve bepalingen van de lokalisatie van zinkionen in de zaadcel en de zaadvloeistof. Hoewel er op ultrastructureel niveau (figuur 2A) geen verschillen in het zinkiongehalte van de spermatozoa werden waargenomen bij de monsters met een hoog of laag totaal zinkgehalte, zouden de kenmerken die op lichtmicroscopisch niveau (figuur 1) werden waargenomen een relatie kunnen weerspiegelen tussen de totale hoeveelheid zink en vrije zinkionen in het zaadplasma. In recente studies hebben Lewis-Jones e.a. (1996) en Carpino e.a. (1998) geconcludeerd dat het totale zinkgehalte in de zaadcellen een onbetrouwbare marker is van de spermatogene activiteit en suggereren zij dat biobeschikbare zinkionen gebonden aan vesiculaire eiwitten met een hoog moleculair gewicht een betere index zijn. De hier gepresenteerde AMG-methode toont chelateerbaar zink aan, d.w.z. zinkionen in het plasma of zink dat losjes gebonden is aan macromoleculen. Zink dat stevig aan eiwitten is gebonden, zal niet door AMG worden gedetecteerd en kan niet in chelaatvorm worden gebracht. Wij zijn het met de genoemde studies eens dat het biobeschikbaar (dus chelateerbaar) zink is dat functies uitoefent op spermacellen, waaronder beweeglijkheid. Deze studie geeft aan dat de totale zinkconcentratie en de chelateerbare zinkconcentratie aan elkaar gerelateerd zijn. Verdere studies zijn noodzakelijk, en gecomputeriseerde beeldanalyse van b.v. AMG preparaten zou een belangrijk hulpmiddel kunnen zijn.

In tegenstelling tot de effecten van zink bleek een hoge magnesiumconcentratie op zichzelf geen remmend effect te hebben op de beweeglijkheid van spermacellen. Er werd een negatief effect op LIN gevonden, maar dit was niet groot genoeg om enig effect te hebben op de andere CASA-parameters. Er is gerapporteerd dat menselijk zaadplasma secretorische korrels en blaasjes van prostaatoorsprong bevat die een regulerend effect op de beweeglijkheid van sperma kunnen hebben door de concentratie van essentiële kationen in hun omgeving te moduleren (Stegmayr et al., 1982). De membranen van deze organellen bevatten Mg2+- en Ca2+-afhankelijke ATPase die competitief worden geremd door Zn2+ (Ronquist et al., 1978a,b). Een hoge positieve correlatie tussen zink en magnesium in het zaadplasma is eerder gerapporteerd (Papadimas et al., 1983; Umeyama et al., 1986), en in deze studie werden vergelijkbare sterke intercorrelaties tussen alle drie kationen gevonden (r = 0,79-0,86, P < 0,01).

Calcium is belangrijk voor de fysiologie van sperma, waaronder motiliteit (Morton et al., 1974; Lindemann et al., 1987), metabolisme (Peterson and Freund, 1976), acrosoomreactie, en bevruchting (Yanagimachi and Usui, 1974; Yanagimachi, 1981). De rol van seminaal calcium in de beweeglijkheid van sperma is echter niet volledig begrepen. Thomas en Meizel (1988) vonden dat chelatie van extracellulaire calciumionen met EGTA de acrosoomreactie remt, maar tegelijkertijd geen effect heeft op de beweeglijkheid. Toevoeging van de acrosoomreactie-inducerende divalente kationionofoor ionomycine had evenmin effect op de motiliteit, maar verhoogde het aantal acrosoom reagerende zaadcellen aanzienlijk. Magnus et al. (1990) vonden geen verband tussen geïoniseerde calciumconcentraties en het aandeel spermatozoa dat progressieve beweging vertoonde. Arver en Sjöberg (1982) hebben gemeld dat een laag geïoniseerd calcium geassocieerd is met meer en beter progressief bewegende spermatozoa. Prien et al. (1990) vergeleken de beweeglijkheid, snelheid en progressieve beweging van spermatozoa met totaal en geïoniseerd calcium bij patiënten met normale (>60%) en verminderde (<60%) beweeglijkheid van spermatozoa. Er werd geen verschil in totaal calcium gevonden, maar een statistisch significante daling van geïoniseerd calcium in de zaadcellen werd gevonden bij mannen met verminderde beweeglijkheid. In deze studie werd totaal calcium gemeten, maar de calciumbindende capaciteit van het zaadplasma is niet bekend. Voor calcium werd geen effect op de beweeglijkheid vastgesteld en de correlaties met de CASA-parameters waren zwakker dan die voor zink (tabel II). Zowel VSL als LIN vertoonden een omgekeerd significante correlatie met de totale calciumconcentratie (P = 0,02 voor beide), terwijl VCL niet beïnvloed werd. Maar toevoeging van zinkconcentratie in een meervoudige regressieanalyse verwijderde de effecten van totale calciumconcentratie op motiliteit. Dit is in overeenstemming met de eerder genoemde studie van Prien et al. (1990). In deze studie vertoonden monsters met een lage zink:calcium verhouding statistisch significant betere CASA waarden (VSL, LIN, en STR) vergeleken met die met een hoge verhouding. Dit is voornamelijk te wijten aan verschillen in zinkconcentratie.

De precisie van zink-, magnesium- en calciumbepalingen in deze studie was relatief slecht, met variatiecoëfficiënten van respectievelijk 18, 32 en 17%. De reden hiervoor is waarschijnlijk de inhomogeniteit van de monsters, die in combinatie met de kleine monstervolumes (20 μl) de precisie kan hebben aangetast. Ondanks de grote onnauwkeurigheid was de variatie in de zink- en magnesiumbepalingen gering in vergelijking met het grote concentratiebereik in de monsters.

Er is eerder aangetoond dat chelatie van zinkionen de beweeglijkheid van sperma beïnvloedt bij de mens (Danscher en Rebbe, 1974), rat en hond (Saito et al., 1967; Stoltenberg et al., 1997). Studies met intra- en extracellulaire chelatie van zinkionen worden momenteel uitgevoerd en dit zou het belang van de locatie van zinkionen in de zaadvloeistof en de spermacel kunnen onthullen.

De auteurs danken mevrouw H. Brandstrup, mevrouw D. Jensen, mevrouw K. Lunding, mevrouw K. Wiedemann, mevrouw Anna Akantis en de heer A. Meier voor hun vakkundige technische bijstand. De Deense Studiegroep voor Vruchtbaarheid steunde deze studie die deel uitmaakt van een gezamenlijke vervolgstudie over de milieu- en biologische determinanten van de vruchtbaarheid. Het project wordt gecoördineerd door het Steno Instituut voor Volksgezondheid, Universiteit van Aarhus, en wordt uitgevoerd in samenwerking met de afdeling Groei en Voortplanting, Nationaal Academisch Ziekenhuis in Kopenhagen. De studie werd hoofdzakelijk gesteund door een subsidie van de Onderzoeksstichting van de Universiteit van Aarhus (J 1994-7430-1). Aanvullende steun werd ook verleend door de Deense Raad voor Medisch Onderzoek (J 12-2042-1), de Deense Stichting voor Ziekteverzekering (J 11/243-91, J 11/236-93), Fonden til Lægevidenskabens Fremme (A.P.Møller) en de Stichting Ciconia.