1.4.3.2 Mosquitos
Mosquitos são vetores de doenças humanas graves, tais como malária, dengue e febre amarela, e apesar dos esforços para controlá-los, eles continuam sendo um problema sério. A identificação de novos genes de mosquitos envolvidos no olfato, alimentação do sangue, digestão, reprodução, imunidade, etc., deve fornecer as bases para o desenvolvimento de novos métodos de controle de populações de mosquitos e doenças transmitidas por mosquitos (Chen et al, 2008).
A informação recente da sequência genómica para três grandes vectores mosquiteiros, Anopheles gambiae, Aedes aegypti, e Culex pipiens quinquefasciatus (http://www.vectorbase.org/), tem sido usada para estudos comparativos de genómica e de perfil transcripcional que estão a permitir a identificação de grandes matrizes de novos genes de mosquitos. O RNAi tornou-se rapidamente a ferramenta de escolha para caracterizar a função dos genes em diversos campos da biologia dos mosquitos e das interacções mosquito-patogénicas (por exemplo, Fragkoudis et al., 2009). Isto resultou na publicação de numerosos ensaios funcionais de RNAi neste grupo de organismos, incluindo membros das aedinas (A. aegypti, Armigeres subalbtus e C. pipiens) e anophelines (A. gambiae e Anopheles stephensi). A maioria destes estudos, contudo, focalizaram-se apenas em duas espécies: o principal vector de dengue e febre amarela, A. aegypti, e o vector africano da malária, A. gambiae (Quadro 1.1).
Nesses estudos, a estratégia experimental típica envolveu microinjeção do dsRNA no tórax de mosquitos adultos seguida de alimentação, desafiando com patógenos, odorantes, inseticidas ou condições de estresse, e o subseqüente exame dos mosquitos para analisar o efeito fenotípico do silenciamento do gene alvo no processo fisiológico em estudo, incluindo olfato, alimentação, digestão e metabolismo, estresse, desintoxicação, formação de cutículas, reprodução, imunidade e regulação da diapausa. A seguir, apresentamos alguns estudos representativos do RNAi em mosquitos.
Olfato medeia uma ampla gama de comportamentos tanto de adultos como de larvas de mosquitos, incluindo alimentação, preferência de hospedeiros, localização/seleção de companheiros e locais de reprodução para oviposição. Olfacto envolve a percepção de estímulos químicos fornecidos por moléculas odoríferas e desenvolvimento de respostas específicas a tais estímulos. Os odorantes são capturados por proteínas de ligação ao odor (OBP), que os transportam para os receptores odoríferos (OR) nas membranas dendríticas dos neurônios olfativos. Os recentes alvos RNAi dos genes OBP e OR forneceram informações valiosas sobre sua função no mecanismo e especificidade do olfato (Biessmann et al., 2010; Liu et al., 2010; Pelletier et al, 2010), abrindo a oportunidade de modificar a percepção do olfato e assim uma gama de comportamentos que poderiam resultar na prevenção da picada e acasalamento de mosquitos.
Em climas temperados, os mosquitos fêmeas adultas passam o inverno em diapausa, um período de dormência que é caracterizado pela ausência de comportamento de procura de hospedeiros, o acúmulo de enormes reservas de gordura e uma parada no desenvolvimento ovariano. A manipulação da regulação deste episódio de dormência poderia resultar, por exemplo, na indução de mosquitos adormecidos, não hospedeiros. Isto foi exemplificado em vários estudos da equipa do Dr. Denlinger. Em particular, eles usaram recentemente o RNAi para investigar o mecanismo de diapausa em C. pipiens, para evidenciar a participação do caminho de sinalização de insulina/FOXO na regulação da diapausa (Sim e Denlinger, 2008, 2009a). Eles também têm evidências do envolvimento de algumas síntases de ácidos graxos no acúmulo de reservas de gordura em fêmeas em período de inverno (Sim e Denlinger, 2009b), e do papel das proteínas ribossômicas S3 e S2 no desenvolvimento folicular em fêmeas não diapausantes (Kim e Denlinger, 2010; Kim et al., 2010).
Vitellogenesis e reprodução também têm sido caracterizadas pelo RNAi em mosquitos. Semelhante à situação dos carrapatos, os mosquitos anautogénicos requerem a ingestão de sangue do hospedeiro vertebrado para iniciar um ciclo reprodutivo envolvendo a produção de ovos. Os aminoácidos (AA) derivados da farinha de sangue são usados pelo corpo de gordura do mosquito para sintetizar precursores da proteína da gema, principalmente a vitellogenina (Vg), em um processo denominado vitellogenesis. Vg é então liberada para a hemolinfa e absorvida pelos ovários e depositada no desenvolvimento de oócitos através de um VgR específico.
No mosquito A. aegypti, a expressão do gene Vg tem sido intensamente estudada pela equipe do Dr. Raikhel em uma longa série de elegantes experimentos, nos quais eles usaram RNAi como ferramenta para a genômica funcional reversa. Esta equipa demonstrou que a transcrição do gene Vg é regulada de forma rigorosa através da combinação de várias moléculas, incluindo a hormona esteróide 20-hidroxiecdisona (20E) em cascata e a sinalização nutricional AA/Target-of-Rapamycin (TOR). Esta serina/treonina quinase é responsável pela transdução do sinal AA, ativando a fosforilação da quinase S6 que é necessária para a ativação de eventos translacionais (Park et al., 2006; Roy e Raikhel, 2011). Além disso, através da injeção de um antagomir específico, a mesma equipe produziu o esgotamento mediado pelo RNAi miR-27, a fim de demonstrar a função do miR-27 como regulador positivo tanto na digestão do sangue quanto no desenvolvimento dos ovos. Na verdade, o miR-27 per se é regulado pelas vias 20E e AA/TOR (Bryant et al., 2010).
O sistema imunológico inato dos vetores mosquitos compreende três categorias funcionais de genes envolvidos no reconhecimento de patógenos, sinalização de vias mediadoras da amplificação, modulação e mecanismos de transdução e efeito mediadores da depuração do patógeno do hospedeiro (Baton et al., 2008). O RNAi é em si mesmo um importante mecanismo imunológico antiviral em mosquitos. Na imunidade antiviral baseada no RNA, o dsRNA viral é reconhecido e processado em siRNAs pelo Dicer mosquito. Depois disso, estes siRNAs derivados do vírus guiam a imunidade antiviral específica através do RNAi e mecanismos silenciadores do RNA relacionados (Ding, 2010). Diversos artigos relatam o uso de RNAi para caracterizar a função dos genes imunológicos dos mosquitos. Estudos sobre mecanismos imunológicos gerais e efetores têm focado em receptores de reconhecimento de padrões, moléculas antibacterianas e antifúngicas de sinalização e proteínas envolvidas em outros mecanismos efetores celulares (revisado em Dong et al., 2006; Moita et al., 2005; Shin et al., 2003, 2006; Wang et al., 2006).
RNAi também tem sido usado na caracterização da interface mosquito-patógeno, muitas investigações olhando para moléculas de mosquito relacionadas à imunidade. As interacções moleculares na interface mosquito-patogénico asseguram a sobrevivência e desenvolvimento tanto do patogénico como do vector. Portanto, a compreensão das interações moleculares entre os patógenos e seus vetores mosquitos é fundamental para o desenvolvimento de novas medidas de controle. Na última década, um intenso esforço de pesquisa tem sido empregado para a identificação e caracterização funcional dos genes dos mosquitos envolvidos nas respostas imunológicas induzidas pelos patógenos, usando uma variedade de abordagens, incluindo genômica comparativa, perfil transcripcional e análise funcional baseada em RNAi (Baton et al., 2008). Estes esforços têm sido concentrados principalmente em duas associações mosquito-patogénicas, A. gambiae-Plasmodium sp. e A. aegypti-dengue virus 2 (DENV-2). As respostas imunes inatas do mosquito à infecção pelo arbovírus foram revistas em detalhe por Fragkoudis et al. (2009), e as respostas aos parasitas da malária foram recentemente revistas por Brown e Catteruccia (2006) e Baton et al. (2008), incluindo abordagens RNAi.
A maior parte destes estudos baseados no RNAi tem visado genes dos mecanismos de defesa imunológica do mosquito em vez dos genes necessários aos agentes patogénicos para se desenvolverem no vector mosquiteiro. Em relação aos genes anti-maláricos submetidos ao RNAi knock-down, a maioria deles são aqueles envolvidos na matança e melanização de ookinete durante a penetração do mosquito (revisado em Brown and Catteruccia, 2006; Baton et al., 2008). Com relação aos genes antivirais dos mosquitos submetidos ao knock-down, alguns são componentes de vias de sinalização, enquanto outros fazem parte da defesa antiviral baseada no RNAi (revisado em Fragkoudis et al., 2009).
entre os trabalhos mais recentes, Guo et al. (2010) apresentam uma abordagem útil para identificar as novas proteínas A. aegypti interagindo com o DENV-2. Estes autores desenvolveram o primeiro rascunho da rede de interação da proteína mosquito utilizando uma abordagem computacional e identificaram 714 putativas proteínas associadas ao DENV A. aegypti que se agrupam em quatro categorias funcionais principais (replicação/transcrição/tradução, imunidade, transporte e metabolismo). Dez dessas putativas proteínas associadas ao DENV foram selecionadas aleatoriamente para validação pelo silenciamento do gene mediado por RNAi, e o título viral do dengue em entranhas de mosquito foi significativamente reduzido para cinco delas.
Colectivamente, estes resultados apoiam a noção de que o RNAi poderia ser uma ferramenta poderosa para a caracterização de alto rendimento do sistema imunitário dos vectores de doenças de insectos, contribuindo assim para a identificação e caracterização de potenciais alvos de mosquitos para o desenvolvimento de novos métodos de controlo de populações de mosquitos, parasitas dentro dos mosquitos e doenças transmitidas por mosquitos.
Após a descoberta de que o RNAi é uma das principais defesas do mosquito contra os arbovírus, tem sido relatado que a supressão deste caminho aumenta a carga viral nos mosquitos infectados (Sanchez-Vargas et al.., 2009). Cirimotich et al. (2009) usaram um vírus Sindbis desenvolvido para expressar uma proteína que se liga ao dsRNA e presumivelmente o protege do processamento no caminho do RNAi, agindo assim como um supressor do RNAi. Este vírus produzido produz muito mais partículas de vírus do que o normal em mosquitos infectados e é letal para várias espécies de mosquitos (A. aegypti, Aedes albopictus, C. trithaeniorhynchus). Esta abordagem é um exemplo de desenvolvimento baseado em nova genética, potencialmente útil em estratégias de “supressão populacional” para controle de mosquitos (Alphey, 2009).
O objetivo oposto, ou seja, o reforço artificial da imunidade ao mosquito antiviral baseado em RNAi para obter mosquitos resistentes ao vírus, também foi desenvolvido. O RNAi antiviral tem sido usado para conferir resistência ao DENV em mosquitos transgênicos A. aegypti, expressando um RNA de grampo de cabelo correspondente a um fragmento do vírus (Franz et al., 2009). Usando promotores específicos de tecido e tempo, a expressão do RNA do grampo capilar pode ser limitada ao meio do intestino – as primeiras células a serem infectadas – e somente após a refeição de sangue, minimizando potenciais problemas de aptidão ao mosquito derivados da expressão constitutiva de um RNA do grampo capilar longo. Uma discussão sobre as vantagens e problemas do uso deste tipo de cepas de mosquitos transgênicos resistentes em estratégias de “reposição populacional” para controle de mosquitos pode ser encontrada em Alphey (2009).