Microscopia este esențială în multe aspecte ale micologiei. Ea are 3 utilizări principale:

1. Detecția ciupercilor direct în probele clinice – aspectele particulare pot fi foarte caracteristice anumitor infecții, de exemplu infecția cu Zygomycete sau India Ink în lichidul cefalorahidian. Microscopia directă, dacă este pozitivă, este mai rapidă decât cultura.
2. Confirmarea faptului că o cultură a unei ciuperci din aer, cum ar fi Aspergillus, este cauza infecției și este puțin probabil să fie un contaminant.
3. Identificarea ciupercilor, pe baza aspectelor morfologice.

Secțiunea de mai jos este destul de tehnică și specifică și este scrisă pentru lucrătorul de laborator care dorește să îmbunătățească ratele de detecție și abilitățile de raportare.

Acest tabel prezintă principalele tipuri de probe și constatări utilizate pentru microscopia directă.

Eșantion	Fungi detectabile și aspect
CSF	Iezi de Cryptococcus	Preparare cu cerneală de India.
Răsături de păr, unghii și piele	Hipocite de dermatofiți sau alte ciuperci filamentoase Iezi de Candida	Fungii diferite care nu se disting. Culturile sunt adesea negative, astfel încât microscopia este singura dovadă a infecției.
Mucoasa din sinusurile paranazale	Hyphae detectabile în mucus este diagnosticul de rinosinuzită fungică eozinofilă	Mucoasa trebuie fixată și colorată ca pentru secțiunile histopatologice. Hifele pot fi evazive.
Dezbaterile/raclatul urechii	Hifele, de obicei cu capete sporulante tipice pentru Aspergillus niger.	Ocazional amestecate cu Candida și celule de drojdie.
Screamarea corneei pentru cheratită	Se pot vedea erete sau ciuperci filamentoase	Semne timpurii utile de cheratită micotică, nu distinge speciile cauzatoare
Aspirație de țesut sau biopsie	Hipocite de ciuperci filamentoase Hipocite de Candida sau alte drojdii. Sferule de C. immitis	Câteva ciuperci foarte distinctive, inclusiv drojdii mici fără hifă, sugestive pentru C. glabrata, sau hifă neseptată a unui Zygomycete.
Fluidele respiratorii	Hife fără semnificație Hifae (fără drojdii) compatibile cu boala Pneumocystis jirovecii	Hifae de obicei septate și tipice de Aspergillus, dar dacă nu sunt septate, atunci luați în considerare zigomicoza sau mucormicoza. Imuunofluorescență superioară pentru P. jirovecii
Film de sânge sau măduvă osoasă	Levuri intracelulare tipice de Histoplasma sau rareori Penicillium	O caracteristică a histoplasmozei diseminate și se găsește în 40%.
Lichidul peritoneal	Leziuni sau rareori hife	Util în confirmarea Candida. peritonită
Sablon/ frotiu vaginal	Candida albicans (drojdii și hife) sau Candida glabrata	Key test de diagnostic
Granul de micetom	Poate prezenta hife cu caracteristici	De obicei nu este definitiv în ceea ce privește specia

Metodologie de conservare

Cel mai vechi preparat specific pentru microscopie este un concentrat (10-20%) soluție de hidroxid de potasiu, care înmoaie keratina și permite vizualizarea directă a ciupercilor și o anumită evaluare a morfologiei. Colorațiile Gram sunt mai puțin sensibile. Colorațiile Papanicolau pot fi utile. Lamele pentru citologie pot fi colorate cu colorații cu sliver sau Gomori Methenamine Silver (GMS). Microscopia de imunofluorescență este cea mai bună metodă de detectare a Pneumocystis. Luminificatorii fluorescenți (Calcofluor white, Blankophor sau Tinopal UNPA-GX), care se leagă de chitina din peretele celular al ciupercii, reprezintă un mijloc rapid de scanare a probelor pentru identificarea hifelor fungice și îmbunătățesc evaluarea morfologică.

Rolul diagnostic al microscopiei în boli specifice

CSF și meningită

Celulele încapsulate de Cryptococcus pot fi adesea detectate în eșantioane de CSF sau alte fluide sau secreții ale gazdei montate în cerneală de India. Aproximativ 50% dintre pacienții HIV-negativi și mai mult de 80% dintre pacienții HIV-pozitivi au un examen pozitiv cu cerneală de India al LCR. Cu toate acestea, limfocitele intacte, în special, pot fi confundate cu organismul. La persoanele cu SIDA, celulele Cryptococcus sunt de obicei abundente în LCR, deși capsulele pot fi mici, ceea ce face dificilă recunoașterea. Descoperirile persistente pozitive în LCR la pacienții aflați sub tratament ar trebui să fie considerate dovezi de eșec sau recidivă numai dacă sunt confirmate de o deteriorare a stării clinice a pacientului sau de culturi pozitive.

Preparat cu cerneală de India din LCR care arată multiple drojdii cu capsule mari și muguri înguste către celule fiice mai mici, tipice pentru C. neoformans

Micrografie electronică de transmisie a unei celule de C. neoformans observată în LCR la un pacient cu SIDA, cu o capsulă remarcabil de mică prezentă. Aceste celule pot fi confundate cu limfocitele.

O ciupercă filamentoasă din LCR al unui pacient cu meningită care a crescut ulterior în cultură cu Candida albicans.

Păr

Specimenele din scalp trebuie să includă rădăcinile părului, conținutul foliculilor obturați și solzii pielii. Cu excepția favusului, porțiunea distală a părului infectat rareori conține vreo ciupercă. Din acest motiv, firele de păr tăiate fără rădăcini sunt nepotrivite pentru investigații micologice. O metodă utilă pentru colectarea de material de pe scalp este prelevarea de probe din peria de păr.

Examinarea microscopică directă a materialului infectat ar trebui să evidențieze artroconidii ale dermatofizilor situate în afara (ectothrix) sau în interiorul (endothrix) firului de păr afectat. Artroconidiile pot fi fie de dimensiuni mici (2-4 um în diametru), fie mari (până la 10 um în diametru). Solzii de piele vor conține hife și artroconidii. În cazul infecției cu T. schoenleinii (favus), se observă lanțuri libere de artroconidii și spații de aer în interiorul firelor de păr afectate. Scutulum (crusta) este format din miceliu, neutrofile și celule epidermice.

Răscatul de piele care arată hife filamentoase cu blankophor.

Unghiile

Calitatea specimenului prelevat este un factor major în succesul sau nu al microscopiei și culturii. Prelevarea unui specimen ar trebui să fie nedureroasă, cu excepția unui ușor disconfort ocazional atunci când se prelevează specimene subunghiale. Figura de mai jos arată locurile adecvate din care ar trebui să se obțină specimene de unghii,

Răfuielile prelevate cu un bisturiu contondent sau tăieturile trebuie transportate într-un pătrat de hârtie împăturit, de preferință fixat cu o agrafă de hârtie, dar sunt disponibile și pachete micologice comerciale. În laborator, o soluție de hidroxid de potasiu de 20-30% se adaugă la o parte din specimen pentru a se maceră cheratina unghiei, astfel încât specimenul să poată fi examinat pentru elemente fungice prin microscopie directă. Alternativ, o parte din fiecare probă este examinată în soluție de dizolvare a unghiilor care conține un fluorocrom . Un exemplu de soluție reactivă este aceasta. Aceasta se prepară prin dizolvarea a 1 g de Na2S în 7,5 ml de apă distilată și adăugarea ulterioară a 2,5 ml de etanol. Ulterior, la acest amestec se adaugă 10 ml de Blankophor sau 20 ml de soluție apoasă de Tinopal UNPA-GX (Fluorescent brightener 28, F3543; Sigma) la 1%.

Mucoz din sinusurile paranazale

O caracteristică diagnostică a rinosinuzitei fungice alergice (AFRS) este prezența mucusului eozinofilic care conține hife, recoltat din nasul pacientului sau din cavitățile sinusurilor paranazale, fără dovezi de invazie tisulară de către ciupercă. Hifele pot fi rare în conținutul sinusurilor și necesită un timp considerabil pentru a fi vizualizate cu ajutorul coloranților utilizați în prezent. Fără această caracteristică pozitivă, de obicei se pun alte diagnostice, inclusiv rinosinuzita alergică (ARS) sau rinosinuzita cu mucină eozinofilă (EMRS). Cu toate acestea, utilizarea unor tehnici de diagnostic mult mai sensibile, cum ar fi colorația cu chitină sau colorațiile de imunofluorescență specifice anti-Alternaria, poate îmbunătăți sensibilitatea. Caracteristicile diagnostice de susținere includ prezența cristalelor Charcot-Leyden, eroziunea osoasă și opacitatea eterogenă cu expansiune sinusală pe tomografia computerizată.

Canal auditiv și otită externă

Debrisul și secrețiile trebuie obținute din canalul auditiv. Examenul microscopic direct va evidenția hife ramificate, celule de drojdie înmugurite sau ambele. În cazurile de infecție cu Aspergillus, uneori pot fi observate capetele tipice de sporoză.

Răzuirea corneei pentru cheratită

Ceratita fungică este o urgență medicală și trebuie recunoscută și tratată prompt. Pentru diagnosticul microbiologic, cel mai bun specimen este materialul din partea afectată a corneei; materialul poate fi colectat sub formă de răzuire dintr-o zonă ulcerată sau biopsie atunci când epiteliul cornean este intact și infecția este limitată la stroma corneană. Răzuirea corneei se obține cu ajutorul unui instrument precum spatula de platină, lama Beaver, cuțitul Bard Parker nr. 15 sau cuțitul blunt pentru cataractă. Tampoanele cu vârfuri de bumbac sunt mai puțin eficiente pentru debridarea sloiurilor corneene necrotice. Materialul trebuie să fie colectat de la baza și marginile părții ulcerate a corneei în mod repetat. Dacă materialul a fost împrăștiat pe un mediu steril, aceeași lamă sau spatulă poate fi folosită din nou pentru a colecta material suplimentar; cu toate acestea, dacă materialul a intrat în contact cu o lamă de microscop nesterilă, lama trebuie schimbată, în timp ce spatula poate fi flambată, răcită și apoi reutilizată.

Examinarea microscopică directă a frotiurilor colorate de material de răzuire a corneei este cel mai rapid mijloc de a pune un diagnostic prezumtiv. Hifele hialine septate de ciuperci filamentoase observate ar putea reprezenta specii de Aspergillus, Fusarium sau Acremonium. Pot fi observate hife septate colorate ale unor feohifomicete precum Curvularia. Ocazional, Candida spp. este cauza cheratitei și, prin urmare, pot fi observate drojdii și hife, sugerând acest diagnostic. Microscopia confocală poate fi un mijloc mai direct de stabilire a diagnosticului.

ab
a. răzuirea corneei cu albastru de bumbac lactofenol arată hife separate cu Fusarium spp sau Aspergillus spp. Dr. Philip Thomas, Tiruchirappalli ( a &b )
b. O altă raclă corneană colorată cu albastru de bumbac lactofenol care arată hife septate în formă de fagure, care nu sunt tipice nici pentru Fusarium spp, nici pentru Aspergillus spp, fiind mai degrabă în concordanță cu o ciupercă dematică (adică de culoare brună)

Tesut și fluide peritoneale
Dezvăluirea microscopică a celulelor de drojdie tipice înmugurite, a pseudohipofagelor și/sau a hifelor adevărate ale speciilor de Candida în secțiuni de țesut sau în fluidele corporale în mod normal sterile este un indiciu al candidozei invazive. În mod obișnuit, C. glabrata produce numai celule de drojdie și numai C. albicans produce hife adevărate în țesuturi

Corectură grafică a unui lichid centrifugat (în acest caz urină) care conține C. albicans, care arată formele de drojdie și de hife, atât de des întâlnite în acest tip de probă.

Eșantioane respiratorii
Examinarea sputei este utilă în ABPA, deoarece adesea pot fi observate hife cu eozinofile și cristale Charcot Leyden. Ocazional, infecțiile fungice neobișnuite pot fi diagnosticate prin microscopie atunci când se vizualizează sferule sau drojdii mari, cum ar fi Blastomyces dermatitidis. Aspergillus sau alte hife filamentoase pot fi observate în materialul de spălare bronșică din traheobronșita fungică, uneori cu capete sporulante vizibile. Microscopia are un randament mai mare decât cultura în aspergiloza pulmonară invazivă din probele de BAL, în unele centre, în funcție de metoda utilizată. Niciun studiu nu a comparat metodologiile pentru microscopie sau randamentul culturilor fungice.

Blocul de mucus examinat prin microscopie ușoară cu KOH, care prezintă o rețea de hife hialine ramificate tipice pentru Aspergillus, de la un pacient cu ABPA.

Același preparat dintr-un specimen de BAL care prezintă hife hialine, septate, caracteristice lui Aspergillus, colorate cu Blankophor în stânga și KOH în dreapta.

Preparat KOH al unui lichid respirator care prezintă hife largi și neseptate, tipice unui Zygomycete.

Film de sânge sau măduvă osoasă

Sensibilitatea microscopiei din sânge și măduvă osoasă nu este suficient de mare pentru majoritatea infecțiilor fungice pentru a justifica timpul de examinare a probelor, cu excepția histoplasmozei diseminate și a Penicillium marneffei, de obicei în SIDA.

Granulele de micetom

Diagnosticul micetomului depinde de identificarea granulelor, care trebuie obținute de preferință dintr-o pustule (sinusuri) neînsuflețită, folosind un ac steril. Acoperișul leziunii trebuie să fie ridicat, iar conținutul sinusului, inclusiv eventualele boabe, trebuie stoarse și plasate pe o lamă de sticlă. Fiecare bob trebuie să fie ales, clătit în alcool 70% și apoi spălat în soluție salină sterilă înainte de a fi cultivat. Examinarea microscopică directă a boabelor în hidroxid de potasiu 20% va confirma diagnosticul de micetom și va dezvălui, de asemenea, dacă organismul cauzal este o ciupercă sau o actinomicete. Boabele negre sugerează o infecție fungică; boabele albe minuscule indică adesea o infecție cu Nocardia, iar boabele albe mai mari, de mărimea unui vârf de ac, pot fi fie de origine fungică, fie actinomicotică. Boabele mici, roșii, sunt specifice Actinomadura pelletieri, dar boabele alb-gălbui pot fi de origine actinomicotică sau fungică. Boabele actinomicotice conțin filamente foarte fine (<1 um în diametru), în timp ce boabele fungice conțin mase de hife scurte încâlcite (2-4 um în diametru) care sunt uneori pigmentate.

Denning DW, Evans EGV, Kibbler CC, Richardson MD, Roberts MM, Rogers TR, Warnock DW, Warren RE. Fungal nail disease: a guide to good practice (Raport al unui grup de lucru al Societății Britanice de Micologie Medicală). Br Med J 1995; 311: 1277-1281.

Monod M, Baudraz-Rosselet F, Ramelet AA, Frenk E. Direct mycological examination in dermatology: a comparison of different methods. Dermatologica. 1989;179(4):183-6. PMID: 2695355

Procop GW, Haddad S, Quinn J, Wilson ML, Henshaw NG, Reller LB, Artymyshyn RL, Katanik MT, Weinstein MP. Detectarea Pneumocystis jiroveci în probele respiratorii prin patru metode de colorare. J Clin Microbiol. 2004 Jul;42(7):3333-5. PubMed PMID: 15243109; PubMed Central PMCID: PMC446244.

.