Linda Boettger1,2 och Diane P. Genereux2

1. Stanford University School of Medicine; 2. Broad Institute of MIT and Harvard

För en renrasig hund och ibland till och med en första generationens hybrid bekräftar tjänster för rasbestämning ofta bara det som hundägaren redan vet. Ibland finns en stamtavla tillgänglig, som spårar tillbaka genom flera generationer av renrasiga förfäder och ger i princip fullständig information om husdjurets härstamning. I andra fall leder en ägares omfattande erfarenhet till en korrekt intuition om att öron som är så slappa tillsammans med en näsa som är så skarp måste tyda på fullständig eller nästan fullständig beagleförankring. Däremot ger DNA-baserade slutsatser ofta överraskande slutsatser när de används för att utreda en hunds släktskap.

DNA-baserade slutsatser om släktskap kan ha ett stort praktiskt värde. Den kan användas för att lösa familjediskussioner om en älskad hunds härstamning och kan åtminstone ge utsikter till att skydda ett husdjurs hälsa. Om man till exempel upptäcker att en mutt har anor från en ras som är känd för att ha en hög risk för cancer kan man rekommendera en mer frekvent screening för tumörer.

Som med alla nya metoder är dock inte släktskapsavläsningen utan utmaningar och osäkerheter. Här ger vi en bakgrund som kan vara användbar för dem som överväger en tjänst för härstamning eller som kämpar med att tolka överraskande resultat. Vi börjar med att diskutera de biologiska processer som ger upphov till de fascinerande, komplexa genomerna hos mutanter, och ger sedan en översikt över hur man med befintliga metoder försöker att reda ut denna genomiska komplexitet för att ge insikter om rasens härstamning. Vi avslutar med att diskutera några av de utmaningar som kan äventyra avledningar av anor och kommenterar vilka typer av information som kommer att krävas för att lösa dessa utmaningar under de kommande åren.

Vad är en renrasig hund? Vad är en mutt?

För att komma fram till en exakt definition av en mutt är det lämpligt att se på hur hundar först uppstod. Tillgängliga uppgifter tyder på att initialt tillfälliga interaktioner med människor skulle kunna förklara deras gamla ursprung (Larson och Fuller, 2014). Anta för tillfället att vissa forntida vargar var försiktiga med människor och att andra var jämförelsevis bekväma. Enligt denna tolkning skulle den ökande tillgången på människans matrester i takt med att människopopopulationerna expanderade kunna ha utgjort en ny huvudsaklig födokälla för de mer grupprika vargarna. Så småningom bildade dessa djur en distinkt population av djur som föredrog att leva i närheten av människor och som tenderade att para sig sinsemellan snarare än med sina mer vilda släktingar.

Om det, vilket krävs i alla evolutionära scenarier, fanns en genetisk grund för den egenskap som skiljer dessa två begynnande populationer åt – här skulle det vara en uppsättning mutationer som modulerar en enskild vargs bekvämlighet i närheten av människor – är det möjligt att tillgången till föda i närheten av människopopopulationer förklarar hundens ursprung från deras vilda vargföregångare. Det är viktigt att notera att hundar enligt detta scenario inte domesticerades av människor i sig. Istället skapade människan helt enkelt en miljö som möjliggjorde självdömande av en undergrupp av vargar som av en slump var genetiskt predisponerade för att vara åtminstone lite toleranta mot människor.

Figur 1. De moderna rasernas ursprung. Även om den exakta tidpunkten fortfarande är kontroversiell, anses det allmänt att hundar uppstod som en population som skiljde sig från förfädernas vargar i Eurasien för mellan 10 000 och 40 000 år sedan (Larson och Fuller, 2014). Enligt detta scenario, medan de flesta vargar fortsatte att vara försiktiga med människor och utsatta för naturligt urval i det vilda, kunde några få tolerera livet i närheten av människor, och kanske dra nytta av deras matavfall. Denna undergrupp av vargar gav så småningom upphov till en genetiskt distinkt population av djur som kan leva nära människor. Specifika hundraser uppstod långt mer nyligen, och de flesta raserna bildades för mindre än 150 år sedan (Larson et al., 2012). Under denna process avlades hundar till olika linjer genom selektion för specifika egenskaper som kamp, boskapsskötsel, jakt eller att bara vara en bra följeslagare.

Det anses allmänt att moderna hundraser uppstod för cirka 150 år sedan, under den viktorianska eran – långt efter att hundar etablerats från sina vargföregångare. Denna slutsats kommer från observationen att människor skapar parningspar av hundar som delar egenskaper som anses vara användbara för specifika uppgifter, vilket ger upphov till distinkta grupper av hundar som alltmer berikas med genetiska mutationer som kodar för specifika egenskaper (Larson et al., 2012). Som i alla evolutionära processer uppstod de relevanta mutationerna inledningsvis slumpmässigt och gynnades senare av selektiv avel. Olika grupper, däribland American Kennel Club och Kennel Club of India, definierade så småningom distinkta raser, vilket i slutändan gav upphov till definitionen av en renrasig hund som en hund vars hela härstamning representeras av individer som finns upptagna i stamboken (“Inherited Defects in Pedigree Dogs. Part 2: Disorders That Are Not Related to Breed Standards”, 2010). I samband med de selektiva avelsprocesser som först skapade, och nu upprätthåller, distinkta raser kan en mutt definieras som en hund vars anor går tillbaka till mer än en genetiskt distinkt linje.

Målet med att dra slutsatser om anor är alltså att använda genetisk information från en mutt för att dra slutsatser om vilka hundraser som fanns bland dess förfäder, och för att dra slutsatser om deras relativa genetiska bidrag.

Insamling av DNA från en hund

Det första steget i härstamning är att samla in och extrahera DNA för genetisk bedömning. Lyckligtvis är saliv en utmärkt källa till DNA – och de flesta ägare tycker att det är ganska lätt att samla in det. Med bara några få ögonblick i en hunds mun blir en av de provtagningssvabbar som tillhandahålls av en kommersiell genotypningstjänst vanligtvis belagd med ett överflöd av celler. Dessa celler är mestadels av två typer: vita blodkroppar, som är suspenderade i saliven och hjälper till med immunförsvaret, och epitelceller, som kantar munnen och vanligtvis byts ut ungefär var 24:e timme. När cellerna har samlats in skickas svabben (fig. 2A) till ett företag som utför släktforskning. Där bryts cellmembranen (fig. 2B) och frigör cellkärnan (fig. 2C), som innehåller DNA, och sedan frigörs DNA från kärnan (fig. 2D). Proteiner och andra biomolekyler kan sedan tvättas bort, vilket ger ett DNA-prov av hög kvalitet.

Figur 2. Isolering av DNA för att dra slutsatser om härstamning. Under några få ögonblick i en hunds mun plockar en salivsvabb (A) upp många epitel- och immunceller (B). Därefter kan kärnor (C) isoleras från cellerna och sedan lyseras för att frigöra DNA (D), som sedan kan rengöras och användas för genotypning eller sekvensering.

Trots att denna process för att isolera DNA från salivprovtagning är imponerande robust och kan ge högkvalitativt DNA från både stora hundar, små hundar, vuxna hundar och valpar, är den inte utan mysterier. I sommar samlade vi och några kollegor till exempel in salivprover varje vecka från sex valpar. Till vår förvåning varierade förhållandet mellan vita blod- och epitelceller per salivprov mycket mellan individer och från vecka till vecka. Ännu mer överraskande var att en valp konsekvent hade betydligt fler celler per prov än sina systrar och bröder. Vi hoppas så småningom få veta vad som kan förklara denna dramatiska variation. För tillfället är det dock lugnande att även de prov med lägst avkastning vanligtvis innehåller tillräckligt med DNA för att man ska kunna dra slutsatser om anor.

Hur man gör en mutt: Kromosomförråd och kromosomutbyte

I både människor och hundar bidrar mamman och pappan i stort sett lika mycket till arvsmassan hos sina avkommor. Hundgenomet är uppdelat i 38 par autosomer (människor har 22 uppsättningar) och ett par könskromosomer (även människor har ett par könskromosomer). Var och en av de 38 paren av hundars autosomer består av en kromosom som levereras av ägget från mamma och en som levereras av spermierna från pappa. Mitokondrions arvsmassa, ett litet DNA-fragment som innehåller många gener som är involverade i ämnesomsättningen, kommer alltid från mamma.

För att modellera det genetiska ursprunget för en mutt, låt oss först betrakta parningen av två renrasiga hundar: en hane av typen Labrador retriever och en hona av typen pudel. Spermierna från hanen och äggen från honan, som var och en bär på en kopia av varje kromosom, kombineras för att bilda en blandning av labrador och pudel som bär på en kopia av varje kromosom som varje förälder bidragit med.

Figur 3. Ett ägg från en pudelhona befruktas av en spermie från en labrador retrieverhane och bildar en labrador-pudelblandning. För varje kromosompar har avkomman en kopia som modern bidrar med (lila) och en kopia som fadern bidrar med (rosa). För tydlighetens skull visas bara ett av de 39 kromosomparen för hundar i denna och följande figurer.

I en parallell parning parar sig en beaglehona mamma och en hanmops, vilket ger upphov till en hanmops-beagle mix.

Figur 4. Ett ägg från en beaglehona befruktas av en spermie från en hanmops, vilket ger upphov till en mops-beagle mix. För varje kromosompar har avkomman en kopia som modern har bidragit med (svart) och en kopia som fadern har bidragit med (blå).

För att förstå hur en mutt kommer att innehålla genetiska bidrag från flera olika raser måste vi fortsätta framåt till nästa generation. Som tidigare bidrar både mamma – här en labradoodle – och pappa – här en puggle – med en av kromosomerna i varje par. Men i stället för att föra vidare samma kromosomer som de själva har ärvt bidrar föräldrarna med rekombinerade kromosomer, som är en kombination av fragment från deras egna föräldrar (figur 5). I det här exemplet skulle den resulterande valpen kallas mutt och har DNA som härrör från förfäder av fyra olika raser.

Figur 5. Ett ägg från en labradorpudelhona befruktas av en spermie från en hane av typen mops-beagle mix och bildar en mutt. För varje kromosompar ärver avkomman en kromosomkopia från modern (lila och rosa) och en kromosomkopia från fadern (svart och blå). Vid denna parning är de två föräldrarna själva blandade. När labrador-pudelblandningen producerar ägg och mops-beagelblandningen producerar sperma innehåller därför de resulterande kromosomerna DNA från mer än en ras.

Rekombination innebär ett rättvist byte av genetiskt material mellan de två kromosomer som utgör varje par. Varje rekombinationshändelse producerar en ny version av den ursprungliga kromosomen, för vilken den totala mängden genetiskt material är densamma som tidigare, men fördelas annorlunda mellan de två kromosomerna. Observera att rekombination är inneboende i produktionen av spermier och ägg – även hos en renrasig beagle eller pudel byter kromosomerna inom varje par ut delar av varandra. Konsekvenserna blir dock tydligast när de rekombinerande kromosomerna har olika historia.

Inleda en hunds härstamning genom att jämföra med referensgenom från renrasiga hundar

Lokal härstamning fungerar genom att man bestämmer vilken ras som troligen har bidragit med varje del av en hunds arvsmassa. När en slutsats har gjorts för varje kromosomdel kan dessa slutsatser summeras för att uppskatta den totala andelen av muttens genom som varje utpekad ras har bidragit med.

För att kunna utläsa vem som troligen har bidragit med den mest sannolika delen av en viss kromosomdel behöver vi förstås något sätt att skilja mellan de genetiska bidragen från olika raser. Lyckligtvis är det mesta av arvsmassan mycket lika hos alla hundar, men varje ras innehåller specifika genetiska förändringar – så kallade mutationer – som antingen är unika för den, eller åtminstone mycket vanligare hos den än hos någon annan ras. Vissa av dessa mutationer är direkt relevanta för egenskaperna hos en viss ras. Andra råkar bara vara unika eller vanligare hos en ras än hos andra raser, men har ingen känd relevans för rasens specifika fysiska egenskaper. Mutationer av båda typerna är användbara för att dra slutsatser om härstamning. I figurerna 3-6 representeras mutationer som är specifika för enskilda raser och som är användbara för att fastställa rasens härstamning av kromosomernas färg.

Figur 6. Inledande av rasens härstamning genom att jämföra ett muttgenom med en uppsättning referensgenom. För att härleda rasens härstamning för en kuller samlas en uppsättning referensgenom (A) in och jämförs sedan med den aktuella kullens genom (B) för att möjliggöra härledning av härstamning för varje kromosomdel och en uppskattning av de totala bidragen till härstamningen. Muppen ovan antas ha ungefär lika stora bidrag från anor från mops, labrador retriever, pudel och beagle, vilket är förväntat med tanke på att den har en mor- eller farförälder från var och en av dessa fyra olika raser.

Stråken för att fastställa anor för en mutt är då att:

1. Samla in en uppsättning genetiska data från renrasiga hundar (figur 6A)
2. Samla in genetiska data från den aktuella hunden (figur 6B)
3. Genomjämför hundens arvsmassa med en referensgenom, gör de bästa gissningarna om rasens ursprung för varje kromosombit, och summera över dessa kromosomdelar för att uppskatta den totala rastillhörigheten (figur 6C)

Data från även bara en liten del av en hunds arvsmassa kan vara användbara för att fastställa anor

Hundens arvsmassa innehåller cirka 2,5 miljarder kromosomer.5 miljarder nukleotider – de As, Ts, Cs och Gs som utgör DNA. Detta skiljer sig inte drastiskt från de cirka 3 miljarder nukleotider som utgör det mänskliga genomet. I en idealisk värld skulle det naturligtvis vara ekonomiskt möjligt att samla in sekvensdata för hela arvsmassan från varje hund. Under de senaste två decennierna har vi närmat oss detta mål. År 2001, när den första fullständiga sekvensen av människans genom publicerades, kostade det 2,7 miljarder dollar att sekvensera var och en av våra cirka 3 miljarder nukleotider. En massiv minskning av kostnaderna för sekvensering har möjliggjort storskaliga satsningar som 1 000 genomprojektet, som har katalogiserat sekvenser av hela arvsmassan från människor över hela världen.

Trots dessa prissänkningar kostar det fortfarande cirka 1 400 dollar att sekvensera en hunds hela arvsmassa här på Broad Institute’s Genomics Platform. Detta pris är förvisso en stor förbättring jämfört med tidigare priser, men är fortfarande betydande. Lyckligtvis erbjuder genotypning ett billigare – och fortfarande till stor del informativt – alternativ. Till skillnad från sekvensering av hela genomet undersöker genotypning en delmängd nukleotider i genomet. När det gäller hundgenomet, till exempel, analyserar det mest populära chipet cirka 170 000 mutationer.

Det är till en början svårt att föreställa sig hur data från endast cirka 0,000068 % av en muthunds genom (170 000 av 2,5 miljarder) skulle kunna ge en adekvat approximation för genomet som helhet. En del av svaret ligger i detaljerna i den rekombinationsprocess som nämns ovan. Vid varje generation blir de kromosomdelar som härstammar från en viss förfader allt mindre. Trots denna totala minskning av längden förblir kromosomdelarna under många generationer stora i förhållande till hela genomet. Med vissa viktiga förbehåll – och ett erkännande av att vissa fel oundvikligen kommer att inträffa – är det därför vanligtvis rimligt att använda identiteten hos en nukleotid i en muts arvsmassa för att göra en gissning om identiteten hos en angränsande nukleotid (figur 7). Detta tillvägagångssätt, som kallas imputering, har avsevärt förbättrat möjligheterna att till en jämförelsevis låg kostnad härleda komponenter av härstamning hos hundar av blandade raser.

Figur 7. Imputering använder genotypinformation från vissa nukleotider för att göra välgrundade gissningar om andra. För en kromosom som bildats genom rekombination av DNA från pudel (lila) och Labrador retriever (rosa) DNA, möjliggör identifiering av rastillhörighet för positionerna 1 och 2, som Labrador retriever bidrog med, en korrekt gissning om rastillhörighet för det omgivande området. Däremot ligger position 3 nära en brytpunkt mellan kromosomdelar; data från den platsen leder till en korrekt gissning om ursprunget för positioner till vänster men inte till höger om den provtagna positionen.

Hur fungerar ett genotypningschip?

Genotypningschip för hundar som utformats av företag som Affymetrix och Illumina är optimerade för att identifiera mutationer som är relevanta för sjukdomar. Resultatet är att endast den delmängd mutationer som är mest sannolika att vara kliniskt informativa undersöks för varje hund, vilket håller kostnaderna nere.

DNA är en mycket klibbig dubbelsträngad molekyl där varje sträng vill binda till den andra, komplementära sekvensen. I DNA:t hos allt liv på jorden är A (adenin) parat med T (tymin) och C (cytosin) parat med G (guanin). Därför skulle DNA-sekvensen “ATCG” hålla fast vid den komplementära sekvensen “TAGC”. Men även en skillnad på en bokstav (t.ex. “TGGC”) kan hindra de två DNA-bitarna från att binda till varandra. Genotypningschips utnyttjar denna princip om selektiv bindning för att fastställa vilka mutationer som finns hos en viss hund. DNA-sonderna är utformade för att binda delar av en hunds DNA som innehåller den muterade och alternativt den icke-muterade formen av DNA. Dessa korta sekvenser fästs på toppen av ett litet glasobjektsglas som vanligen kallas “chip” eller “array” (figur 8).

Figur 8. Genotypning för att fastställa vilka mutationer varje hund har. DNA-sonderna (korta sekvenser som är komplementära till mutationer av intresse) finns på olika ställen på genotypningsmatrisen. Här illustreras detektion av en av de tusentals mutationer som analyseras av chipet. Efter att hund-DNA har lagts till och tillåtits binda till DNA på chipet tvättas DNA som inte har bundits bort. Därefter tillsätts fluorescerande molekyler som binder till det återstående hund-DNA:t. På detta sätt kan de mutationer som finns hos en hund identifieras genom att visualisera vilka områden på genotypningsarrayen som lyser.

För att säkerställa bindningen till dessa korta genotypningssonder bryts först det DNA som isolerats från en hunds saliv i små bitar. Därefter kopplas en kemikalie till hundens DNA som är bra på att fästa vid fluorescerande molekyler som kommer att vara avgörande för tolkningen av resultaten. Hundens DNA tvättas över chipet och varje sträng binder sin komplementära sondsekvens. På så sätt hittar delar av hundens DNA den matchande sonden på genotypningschipet. Två egenskaper säkerställer specifik bindning och därmed tillförlitliga data. För det första kan en genotypningssond inte binda mutt-DNA som härrör från en annan del av genomet. För det andra kan den inte binda den muterade formen av sekvensen om inte hunden råkar ha den specifika mutationen (dvs. den “A”-sekvens som illustreras ovan). Obundet DNA tvättas bort från objektglaset, och slutligen fästs fluorescerande molekyler på det återstående DNA som framgångsrikt bundit proberna. Eftersom varje sond skapades på en specifik plats på matrisen kan vi tolka vilka mutationer en hund har genom att observera vilka små fläckar på matrisen som lyser.

Faktorer som kan undergräva härstamning

Trots de senaste framstegen kan flera kvardröjande utmaningar undergräva ansträngningarna att korrekt härleda rasavstamning hos hundar av blandade raser.

Figur 9. En anförvant kan endast härledas om det relevanta genomet finns i referensuppsättningen. För raser som är väl representerade bland referensgenomerna och som är väl samplade med en genotypningsarray (t.ex. pudel, mops och labrador retriever i scenariot ovan) kommer man i regel att lyckas identifiera både förekomsten av och den ungefärliga procentuella andelen DNA som nyligen härstammade från rasen i fråga. När det gäller raser som inte är väl representerade bland referensgenomerna (t.ex. beagle i scenariot ovan), felskrivs dock ofta kromosomdelar till en bättre representerad ras (t.ex. bassethound i scenariot ovan), vilket leder till en felaktig bedömning av en hunds härstamning.

Och även om vissa problem kan resultera i att man bara underskattar den procentuella andel av hundens härstamning som härstammar från en viss ras, så kan andra problem förhindra att den korrekta rasen identifieras överhuvudtaget. Det mest betydande av dessa problem är avsaknaden av en sann stamras i referensdatasetet (figur 9). Eftersom rasförankring härleds genom att jämföra delar av mutt-DNA med renrasiga hundar av kända raser, om en ras saknas i referensdatasetetet kan den rasen helt enkelt inte upptäckas, även om den bidrog med en mycket stor del av mutt-DNA:et. Detta problem kommer i slutändan att lösas endast genom att referensgenom från erkända raser inkluderas. Om du är intresserad av att veta om din hund har anor från en viss sällsynt ras, är det viktigt att se till att ditt valfria företag för anorektering av raser kan kontrollera den rasen under tiden. För dem som bestämmer sig för att gå vidare med anhöriginferens trots att man vet att den aktuella rasen saknas i referensuppsättningen är det viktigt att komma ihåg att frånvaron av den rasen i listan över infererade anförvanter inte ger någon information om huruvida hunden verkligen saknar den specifika anhörigheten.

De mutationer som väljs ut för genotypning bestämmer också vilka anförvanter av raser som kan identifieras med precision hos en blandrashund. Arrayer för genotypning tenderar att inkludera fler mutationer som förekommer hos vanliga raser. Detta innebär att delar av kromosomerna från pudlar och schäferhundar kan vara särskilt lätta att identifiera eftersom många av de mutationer som är vanliga hos dessa raser analyseras på genotypningsarrayer. Även om många mutationer skulle kunna hjälpa till att identifiera DNA-bitar från sällsynta raser som Nya Guineas sånghundar eller Skye terrier, kan det hända att vissa av dessa mutationer inte finns representerade på allmänt använda genotypningsarrayer, vilket skulle kunna göra det svårare att identifiera dessa raser. Detta problem kommer så småningom att lösas genom att skapa referensdatamängder för raser med sekvensdata, vilket skulle göra det möjligt att tolka många fler mutationer och skulle inte vara partisk i riktning mot upptäckt av härstamning från specifika raser.

En hunds släktskap med sina renrasiga förfäder påverkar också tillförlitligheten i rasbestämningen. I synnerhet är det lättare att identifiera rastillhörighet för DNA från en renrasig förfader som är en nära släkting (t.ex. en förälder) eftersom mutationer från nyare förfäder kommer att finnas i längre bitar av DNA med mer informativa mutationer. Medan till exempel den första mutationen som observeras på en muttkromosom kan vara vanlig hos både labradorer och golden retrievers, kanske den första, andra och tredje mutationen som observeras endast ses tillsammans hos golden retrievers. DNA från förfäder från många generationer bakåt i tiden kommer endast att finnas i form av korta kromosomdelar, med färre mutationer som hjälper till att identifiera deras bidrag till hundens härstamning, vilket gör det svårare att dra slutsatser. Detta problem kan mildras genom att använda data från sekvensering i stället för genotypning, vilket gör det möjligt att analysera alla mutationer. DNA som ärvs från många generationer bakåt i tiden kan dock vara i kromosomdelar som är så korta att de inte kommer att innehålla kromosomdelar som är karakteristiska för en specifik ras, vilket gör att rasens bidrag till en hunds härstamning inte kan upptäckas ens med helgenomdata (Li et al., 2014).

Vad händer härnäst? Ska jag genotypa min hund?

Som med all ny teknik är rasinferens en spännande möjlighet som introducerar vissa olösta utmaningar. Många hundägare som är nyfikna på att lära sig mer om sitt husdjurs ursprung kommer säkert att uppskatta att ha ett fönster till vilka raser som bidragit till den unika genetiken hos deras mutt. Du kanske till och med får rätt att spekulera i att din hunds utmärkta uthållighet på hög höjd kommer från hennes Lhasa Apso-morförälder (Li et al., 2014)! Vi uppmanar ändå ägarna att vara försiktiga och komma ihåg att en rad olika problem kan äventyra tillförlitligheten i slutsatserna, samtidigt som vi förblir optimistiska om att slutsatserna kommer att förbättras i takt med att referensdata samlas in.

“Inherited Defects in Pedigree Dogs. Del 2: Störningar som inte är relaterade till rasstandarder.” 2010. The Veterinary Journal 183 (1). W.B. Saunders:39-45.

Larson, Greger och Dorian Q. Fuller. 2014. “The Evolution of Animal Domestication”. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 45 (1):115-36.

Larson, Greger, Elinor K. Karlsson, Angela Perri, Matthew T. Webster, Simon Y. W. Ho, Joris Peters, Peter W. Stahl, et al. 2012. “Rethinking Dog Domestication by Integrating Genetics, Archeology, and Biogeography”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109 (23):8878-83.

Li, Yan, Dong-Dong Wu, Adam R. Boyko, Guo-Dong Wang, Shi-Fang Wu, David M. Irwin och Ya-Ping Zhang. 2014. “Population Variation Revealed High-Altitude Adaptation of Tibetan Mastiffs”. Molecular Biology and Evolution 31 (5):1200-1205.