Under 1960-talet nåddes två milstolpar i fysiologin kring tarmens sockerabsorption. Den första var Crane och kollegers hypotes om Na+-glukos-kotransport (1), som förklarade aktiv sockertransport, och den andra var upptäckten av glukos- och galaktosmalabsorption (GGM) hos patienter (5, 6). Kotransporthypotesen har testats ingående, bekräftats och utvidgats till att omfatta “aktiv transport” av en mängd olika substrat in i celler, från laktosackumulering i Escherichia coli till jodidackumulering i sköldkörteln. Kotransportörer är i huvudsak molekylära maskiner som använder energi som lagras i form av elektrokemiska potentialgradienter över cellmembranen, Na+ eller H+, för att driva ackumulationen av specifika lösningsmedel och vatten i cellerna (22). Den intestinala Na+-glukos-kotransportern (SGLT1) använder Na+ och elektriska gradienter över membranet för att driva in socker och vatten i enterocyter mot deras koncentrationsgradienter (9, 13, 23). Glukos och galaktos hanteras båda av SGLT1, medan fruktos transporteras över borstgränsen av sin egen privata transportör, den förenklade fruktostransportören (GLUT5). Glukos, galaktos och fruktos fullbordar sin resa genom cellen och ut i blodet genom en annan förenklad sockertransportör (GLUT2) i det basolaterala membranet (fig. 1).

GGM kännetecknas av neonatal debut av vattnig och sur svår diarré, som är dödlig inom några veckor om inte laktos (glukos och galaktos) avlägsnas från kosten (2). Diarrén upphör när man fastar eller tar bort de felande sockerarterna från kosten, men återupptas snabbt när man ger oralt foder som innehåller laktos, glukos eller galaktos. Absorptionen av fruktos påverkas inte. Med tanke på sjukdomens symtom och vad man då visste om tarmens sockerabsorption förutspåddes att GGM berodde på en defekt i Na+-glukos-kotransportern i borstgränsen. Denna hypotes stärktes av de utsökta autoradiografiska galaktosupptagnings- och phlorizinbindningsexperiment som gjordes på slemhinnebiopsier från den första amerikanska GGM-patienten (17, 18). Dessa experiment visade att minskningen av galaktostransporten var förknippad med en 90-procentig minskning av phlorizinbindningen till borstkanten. Phlorizin är en specifik, icke transporterad, kompetitiv hämmare av SGLT1.

Det mest tillförlitliga diagnostiska testet för GGM är H2-andningstestet (fig. 2). Oral administrering av glukos eller galaktos (2 g/kg) resulterar i en förhöjning av H2 i utandningsluften kraftigt över 20 delar/miljoner hos patienter med GGM, men ingen sådan förhöjning hos kontroller eller patienter som får fruktos. Barn med GGM trivs “normalt” med fruktosersättning, men symtomen återkommer även i vuxen ålder med så lite som en tesked glukos (6 g), och H2-utandningsprovet förblir positivt. Sjukdomen är ganska sällsynt. Vi känner till cirka 200 patienter världen över, och en stor andel av fallen kommer från släktskap.

Fysiologin och patofysiologin för intestinal sockerabsorption gjordes framsteg 1987 genom att vi klonade Na+-glukos-kotransportern från kanin med hjälp av en ny strategi som vi kallade “expressionskloning”. Denna framgång följdes snabbt av Turk och Hedigers kloning (4) av den mänskliga Na+-glukos cotransportern och Turk et al. identifierade (20) den första mutationen i en transportör som orsakade en genetisk sjukdom, GGM. Vi erhöll tarmbiopsier från två systrar med diagnosen GGM och blodprover från föräldrarna som är kusiner. Turk et al. (20) identifierade en homozygot, missense-mutation (Asp28Asn) i SGLT1 cDNA från vardera systern, fann att vardera föräldern var bärare av denna mutation och visade att mutationen faktiskt helt upphävde Na+-glukos-kotransporten med hjälp av en oocytexpressionsanalys. I samma släktskap utfördes därefter prenatal screening på två foster och det ena fostret (syskonet till den prövade personen) visade sig vara bärare av Asp28Asn-mutationen och det andra fostret (en kusin) var normalt. Båda barnen har klarat sig bra utan dietrestriktioner och förblivit asymptomatiska i minst två år (11).

Fortsatta framsteg hämmades till en början av svårigheter att få fram slemhinnebiopsiprover från barn med GGM tills Turk et al. (21) lyckades kartlägga hela den mänskliga SGLT1-genen. Genen är stor, med 15 exoner fördelade på 72 kb DNA. När exonerna och deras flankerande regioner hade sekvenserats utvecklades en enkelsträngad konformationell polymorfismanalys för att undersöka patienter för mutationer med hjälp av genomiskt DNA från ett litet blodprov. Utvecklingen innebar PCR-amplifiering av vart och ett av de 15 exonerna och deras intron-exonförbindelser och gelelektrofores av de denaturerade PCR-produkterna för att identifiera exoner med mutationer. Anomala exoner sekvenserades sedan. För att fastställa om mutationerna var ansvariga för defekten i sockertransporten uttrycktes mutanterna i Xenopus laevis oocyter för Na+-glukosupptagningsanalyser. Martı́n (Refs. 10, 12 och opublicerade observationer) var till stor del ansvarig för denna fas av projektet. Mutationer som förklarar sjukdomen identifierades hos 33 av 34 undersökta GGM-patienter. Patienterna i 17 släkter bar på homozygota mutationer, och i ytterligare 10 släkter hade patienterna sammansatta heterozygota mutationer. Dessa omfattade 22 missense-mutationer (se fig. 3) och 4 splice-site- och 3 nonsense-mutationer som resulterar i produktion av ett kraftigt trunkerat SGLT1-protein. Att man inte lyckades upptäcka mutationer hos den 34:e patienten kan bero på att mutationen fanns i genens promotorområde och att DNA från detta område inte ingick i screeningförfarandet.

Som transportfysiolog har jag varit intresserad av GGM-missense-mutationerna på grund av deras potential att identifiera rester i proteinet som är kritiska för transport. Vi har därför satt oss för att fastställa hur missense-mutationer faktiskt orsakar defekten i Na+-sockertransporten. I detta tillvägagångssätt, som till stor del utfördes av Lostao (se referenserna 10 och 12), uttrycktes de muterade proteinerna i X. laevisoocyter och sedan användes biofysiska och biokemiska metoder för att bestämma proteinnivån i cellen och i plasmamembranet. I de fall där transportören var införd i plasmamembranet undersökte vi (7) delreaktionerna i transportcykeln. Vi blev till en början besvikna över att konstatera att med de första 21 studerade missense-mutanter berodde den primära defekten på att transportörerna felplacerades i cellen. På grundval av Western blots syntetiserades alla mutanter i nivåer som liknade eller var högre än vildtypen SGLT. Laddningsmätningar (7) och frysfrakturelektronmikroskopi (24) av oocytens plasmamembran visade dock att antalet kotransportörer i plasmamembranet var kraftigt reducerat (10, 12). Enligt graden av kärn- och komplexglykosylering hos mutanterna inträffade felet i SGLT1:s trafikering till plasmamembranet antingen mellan endoplasmatiskt retikulum och Golgi eller mellan Golgi och plasmamembranet. Felveckning av muterade proteiner kan vara den primära orsaken till transportörens missortering (19). I endast ett fall, Gln457Arg, var det muterade proteinet i oocytens plasmamembran nära normala nivåer.

Vilken betydelse har dessa experiment på oocyter för GGM-patienters tarmar? För att besvara detta undersökte vi (opublicerade data) fördelningen av SGLT1-protein med immunocytokemi i slemhinnebiopsier från tre patienter med homozygota mutationer. Hos alla tre var fördelningen av de muterade proteinerna i oocyten identisk med fördelningen av SGLT1 i patientens enterocyter: hos två fanns proteinet i cytoplasman och hos en fanns proteinet i borstkanten. Det finns också en överensstämmelse mellan våra resultat på oocyter och de resultat som erhållits genom autoradiografiska studier av biopsier från den första amerikanska GGM-patienten (18). Stirling och hans medarbetare (18) fann att bindningen av phlorizin till patientens borstgräns minskade med 90 %, och vi fann inget muterat SGLT1-protein (Cys355Ser och Leu147Arg) i oocytens plasmamembran (10). Dessa studier tyder på att oocyten, åtminstone med dessa fyra GGM-mutanter, rekapitulerar det muterade proteinets beteende i enterocyten.

En viktig kvarstående fråga är hur de missense-mutationer som är fördelade i hela proteinet (fig. 3) stör transportörens trafikering till plasmamembranet. Svaren på denna fråga är viktiga för att förstå biosyntesen av plasmamembranproteiner och för att utforma förbättrade terapier för barn med GGM.

GGGM-mutationen i en släkt, Gln457Arg, har gett ovärderliga insikter i mekanismen för sockertransport. Lostao studerade (under förberedelse) beteendet hos Q457R SGLT1 uttryckt i oocyter och patientens tarmslemhinna och fann att proteinet översätts, glykosyleras och infogas i plasmamembranet, men att det inte kan transportera socker. I avsaknad av socker transporterar det muterade proteinet Na+ genom Na+ läckage eller Na+ uniportvägen, och detta blockeras av phlorizin. Glukos är också en hämmare eftersom det också blockerar denna Na+ -transportväg, vilket tyder på att glukos binder till Q457R SGLT1 men att det inte transporteras, dvs. mutationen ger upphov till en defekt vid translokation av socker. Panayotova-Heiermann och kollegor (15) visade oberoende av varandra att socker-“porerna” genom SGLT1 bildas av den COOH-terminala domänen av SGLT1 som bär rest Q457.

För att utnyttja dessa observationer har vi undersökt Q457:s roll i sockertranslokationen. I denna studie visade sig cysteinmutanten Q457C bibehålla full Na+-glukostransportaktivitet, bortsett från en ökning av den skenbara glukos-Michaelis-Menten-konstanten (Km) från 0,4 till 6 mM, och kemisk mutagenes av Q457C med antingen laddade eller neutrala alkylerande reagens (metanethiosulfonater, MTS) visade sig blockera sockertransporten helt och hållet. Eftersom det alkylerade Q457C-proteinet binder glukos med en dissociationskonstant som är mycket lik den uppenbara Km för sockertransport av Q457C SGLT1, får denna rest dock inte vara en del av sockerbindningsstället. Hämningen av Q457C:s sockertransport med MTS inträffade endast när kotransportern befann sig i den utåtriktade Na+-konformationen, C2 (fig. 4). Reagensen var inte effektiv i frånvaro av Na+, i närvaro av Na+ och glukos (eller phlorizin), eller i närvaro av Na+ vid depolariserade membranpotentialer. Spänningshoppsexperiment med rhodaminmärkt Q457C visade också att tidsförloppet och fluorescensnivån följde kotransporterns övergång mellan konformationerna C2 och C6 noga (fig. 4). Vi tolkar dessa resultat som att cotransportern kan existera i minst tre olika konformationer (C6, C2 och C3) och att kopplingen mellan Na+- och sockertransport sker genom ligand- och spänningsinducerade konformationsförändringar i proteinet.

Förstudier med två andra GGM-missense-mutationer i den COOH-terminala domänen av SGLT1, A468V och R499H (fig. 3), visar att om man ersätter resterna med cystein återställs proteinets trafikering till oocytens plasmamembran. Båda proteinerna är funktionella och sockertransporten blockeras av MTS-reagens. Liksom i fallet med Q457C är dessa rester tillgängliga för MTS-reagens endast när proteinerna befinner sig i C2-konformationen. Dessa resultat stöder min åsikt att transmembranhelikerna 10-13 (fig. 3) bildar sockerporten. Ytterligare arbete krävs för att identifiera Na+-porten.

Sammanfattningsvis har molekylärbiologiska studier av SGLT1 lett till kloning av cDNA för det mänskliga SGLT1 och kartläggning av genen, vilket har gett nya kraftfulla verktyg för att undersöka fysiologin för Na+-glukos-kotransport och för att studera GGM. GGM har bekräftats bero på mutationer i SGLT1-genen, och de flesta av dessa mutationer resulterar antingen i ett trunkerat SGLT1-protein eller i en felaktig transport av transportören i cellen. Som förväntat för en autosomalt recessiv sjukdom ger en privat mutation upphov till sjukdomen i varje släkt och frekvensen av sjukdomen ökar i kulturer med en hög frekvens av samkönade äktenskap. Även om GGM är sällsynt är det möjligt att den större gruppen av individer som bär på milda SGLT1-mutationer, eller allvarliga mutationer på en allel, har nedsatt glukos- och galaktosabsorption. Ungefär 10 % av normalpopulationen, medicinstudenter, gav positiva glukos H2 andningstester (14). Detta gränssnitt mellan fysiologi och sjukdom har inte bara ökat förståelsen för sockerabsorptionens patofysiologi utan har också gett nya metoder för att studera de molekylära mekanismerna för kopplingen mellan Na+- och sockertransport genom plasmamembranen.

FOTNOTER

• * Första i en serie inbjudna artiklar om genetiska störningar av membrantransport.

.