Christian Bohr y el concepto de unión cooperativaEditar
En 1904, Christian Bohr estudió la unión de la hemoglobina al oxígeno en diferentes condiciones. Al trazar la saturación de la hemoglobina con el oxígeno en función de la presión parcial del oxígeno, obtuvo una curva sigmoidal (o “en forma de S”). Esto indica que cuanto más oxígeno se une a la hemoglobina, más fácil es que se una más oxígeno, hasta que todos los sitios de unión están saturados. Además, Bohr observó que el aumento de la presión de CO2 desplazaba esta curva hacia la derecha, es decir, que las mayores concentraciones de CO2 dificultan la unión del oxígeno a la hemoglobina. Este último fenómeno, junto con la observación de que la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno aumenta con el aumento del pH, se conoce como efecto Bohr.
Se dice que una molécula receptora presenta una unión cooperativa si su unión al ligando escala de forma no lineal con la concentración del ligando. La cooperatividad puede ser positiva (si la unión de una molécula de ligando aumenta la afinidad aparente del receptor y, por lo tanto, aumenta la posibilidad de que se una otra molécula de ligando) o negativa (si la unión de una molécula de ligando disminuye la afinidad y, por lo tanto, hace menos probable la unión de otras moléculas de ligando). La “ocupación fraccional” Y ¯ {\displaystyle {\bar {Y}}
de un receptor con un ligando dado se define como la cantidad de sitios de unión del ligando dividida por la cantidad total de sitios de unión del ligando: Y ¯ = + = {\displaystyle {\bar {Y}}={frac {}+}}={\frac {}}}
Si Y ¯ = 0 {\displaystyle {\bar {Y}=0}
, entonces la proteína está completamente desatada, y si Y ¯ = 1 {\displaystyle {\bar {Y}}=1}
, está completamente saturada. Si el gráfico de Y ¯ {\displaystyle {\bar {Y}}
en el equilibrio en función de la concentración del ligando tiene forma sigmoidal, como observó Bohr para la hemoglobina, esto indica una cooperatividad positiva. Si no lo es, no se puede hacer ninguna afirmación sobre la cooperatividad a partir de este gráfico solamente.
El concepto de unión cooperativa sólo se aplica a moléculas o complejos con más de un sitio de unión del ligando. Si existen varios sitios de unión del ligando, pero la unión del ligando a cualquiera de ellos no afecta a los demás, se dice que el receptor no es cooperativo. La cooperatividad puede ser homotrópica, si un ligando influye en la unión de ligandos del mismo tipo, o heterotrópica, si influye en la unión de otros tipos de ligandos. En el caso de la hemoglobina, Bohr observó una cooperatividad positiva homotrópica (la unión del oxígeno facilita la unión de más oxígeno) y una cooperatividad negativa heterotrópica (la unión del CO2 reduce la facilidad de la hemoglobina para unirse al oxígeno.)
A lo largo del siglo XX, se han desarrollado varios marcos para describir la unión de un ligando a una proteína con más de un sitio de unión y los efectos cooperativos observados en este contexto.
La ecuación de HillEditar
La primera descripción de la unión cooperativa a una proteína de sitios múltiples fue desarrollada por A.V. Hill. Basándose en las observaciones de la unión del oxígeno a la hemoglobina y en la idea de que la cooperatividad surgía de la agregación de moléculas de hemoglobina, cada una de las cuales unía una molécula de oxígeno, Hill sugirió una ecuación fenomenológica que desde entonces lleva su nombre:
Y ¯ = K ⋅ n 1 + K ⋅ n = n K ∗ + n = n K d n + n {\displaystyle {\bar {Y}={\frac {K\cdot {}^{n}}{1+K\cdot {}^{n}}={\frac {^{n}}{K^{*}+^{n}}={\frac {^{n}{K_{d}^{n}+^{n}}}}
donde n {{displaystyle n}
es el “coeficiente de Hill”, {\displaystyle }
denota la concentración del ligando, K {\displaystyle K}
denota una constante de asociación aparente (utilizada en la forma original de la ecuación), K ∗ {\displaystyle K^{*}}
es una constante de disociación empírica, y K d {\displaystyle K_{d}}
una constante de disociación microscópica (utilizada en las formas modernas de la ecuación, y equivalente a una E C 50 {\displaystyle \mathrm {EC} _{50}}
). Si n < 1 {\displaystyle n<1}
, el sistema presenta una cooperatividad negativa, mientras que la cooperatividad es positiva si n > 1 {\displaystyle n>1}
. El número total de sitios de unión del ligando es un límite superior para n {\displaystyle n}
. La ecuación de Hill puede linealizarse como: log Y ¯ 1 – Y ¯ = n ⋅ log – n ⋅ log K d {\displaystyle \log {\frac {\bar {Y}}{1-{\bar {Y}}}}=n\cdot {}\log-n\cdot {}\log K_{d}}.
El “gráfico de Hill” se obtiene trazando log Y ¯ 1 – Y ¯ {\displaystyle \log {\frac {{barra {Y}}{1-{barra {Y}}}}}
frente a log {\displaystyle \log}
. En el caso de la ecuación de Hill, es una recta con pendiente n H {\displaystyle n_{H}}
y el intercepto log ( K d ) {\displaystyle \log(K_{d})}
. Esto significa que se supone que la cooperatividad es fija, es decir, que no cambia con la saturación. También significa que los sitios de unión siempre exhiben la misma afinidad, y la cooperatividad no surge de una afinidad que aumenta con la concentración del ligando.
La ecuación de AdairEditar
G.S. Adair descubrió que el diagrama de Hill para la hemoglobina no era una línea recta, y formuló la hipótesis de que la afinidad de unión no era un término fijo, sino que dependía de la saturación del ligando. Tras demostrar que la hemoglobina contenía cuatro hemos (y, por tanto, sitios de unión para el oxígeno), partió de la hipótesis de que la hemoglobina totalmente saturada se forma por etapas, con formas intermedias con una, dos o tres moléculas de oxígeno unidas. La formación de cada etapa intermedia a partir de la hemoglobina no unida puede describirse utilizando una constante de asociación macroscópica aparente K i {displaystyle K_{i}}
. La ocupación fraccionaria resultante puede expresarse como: Y ¯ = 1 4 ⋅ K I + 2 K I I 2 + 3 K I I 3 + 4 K I V 4 1 + K I + K I I 2 + K I I 3 + K I V 4 {\displaystyle {\bar {Y}}={\frac {1}{4}}\cdot {}{\frac {K_{I}+2K_{II}^{2}+3K_{III}^{3}+4K_{IV}^{4}}{1+K_{I}+K_{II}^{2}+K_{III}^{3}+K_{IV}^{4}}}}
Or, para cualquier proteína con n sitios de unión al ligando:
Y ¯ = 1 n K I + 2 K I I 2 + … + n K n n 1 + K I + K I I 2 + … + K n n {\displaystyle {\bar {Y}}={\frac {1}{n}}{\frac {K_{I}+2K_{II}^{2}+\ldots +nK_{n}^{n}{1+K_{I}+K_{II}^{2}+\ldots +K_{n}^{n}}}}
donde n indica el número de sitios de unión y cada K i {{displaystyle K_{i}}
es una constante de asociación combinada, que describe la unión de i moléculas de ligando.Combinando el tratamiento de Adair con el gráfico de Hill, se llega a la definición experimental moderna de cooperatividad (Hill, 1985, Abeliovich, 2005). El coeficiente de Hill resultante, o más correctamente la pendiente del diagrama de Hill calculado a partir de la ecuación de Adair, puede demostrarse que es la relación entre la varianza del número de uniones y la varianza del número de uniones en un sistema equivalente de sitios de unión no interactuantes. Así, el coeficiente de Hill define la cooperatividad como una dependencia estadística de un sitio de unión con el estado de otro(s) sitio(s).
La ecuación de KlotzEditar
Trabajando en proteínas de unión al calcio, Irving Klotz desconvolucionó las constantes de asociación de Adair considerando la formación escalonada de las etapas intermedias, e intentó expresar la unión cooperativa en términos de procesos elementales gobernados por la ley de acción de masas. En su marco, K 1 {\displaystyle K_{1}}
es la constante de asociación que rige la unión de la primera molécula de ligando, K 2 {displaystyle K_{2}}
la constante de asociación que rige la unión de la segunda molécula de ligando (una vez que la primera ya está unida), etc. Para Y ¯ {\displaystyle {\bar {Y}}
, esto da: Y ¯ = 1 n K 1 + 2 K 1 K 2 2 + … + n ( K 1 K 2 … K n ) n 1 + K 1 + K 1 K 2 2 + … + ( K 1 K 2 … K n ) n {\displaystyle {\bar {Y}}= {\frac {1}{n}} {\frac {K_{1}+2K_{1}K_{2}^{2}+\ldots +n\left(K_{1}K_{2}\ldots K_{n}\right)^{n}}{1+K_{1}+K_{1}K_{2}^{2}+\ldots +\left(K_{1}K_{2}\ldots K_{n}\right)^{n}}}}
Cabe destacar que las constantes K 1 {\displaystyle K_{1}}
, K 2 {displaystyle K_{2}}
y así sucesivamente no se refieren a sitios de unión individuales. Describen cuántos sitios de unión están ocupados, en lugar de cuáles. Esta forma tiene la ventaja de que la cooperatividad se reconoce fácilmente al considerar las constantes de asociación. Si todos los sitios de unión del ligando son idénticos con una constante de asociación microscópica K {\displaystyle K}
, uno esperaría que K 1 = n K , K 2 = n – 1 2 K , … K n = 1 n K {\displaystyle K_{1}=nK,K_{2}={\frac {n-1}{2}K,\ldots K_{n}={\frac {1}{n}K}
(es decir, K i = n – i + 1 i K {\displaystyle K_{i}={frac {n-i+1}{i}K}
) en ausencia de cooperatividad. Tenemos cooperatividad positiva si K i {\displaystyle K_{i}}
está por encima de estos valores esperados para i > 1 {\displaystyle i>1}
.
La ecuación de Klotz (que a veces también se denomina ecuación de Adair-Klotz) todavía se utiliza con frecuencia en la literatura experimental para describir las mediciones de la unión del ligando en términos de constantes de unión aparente secuenciales.
Ecuación de PaulingEditar
A mediados del siglo XX, aumentó el interés por los modelos que no sólo describían las curvas de unión fenomenológicamente, sino que ofrecían un mecanismo bioquímico subyacente. Linus Pauling reinterpretó la ecuación proporcionada por Adair, asumiendo que sus constantes eran la combinación de la constante de unión del ligando ( K {\displaystyle K}
en la ecuación de abajo) y la energía procedente de la interacción entre subunidades de la proteína cooperativa ( α {\displaystyle \alpha }
abajo). Pauling derivó en realidad varias ecuaciones, dependiendo del grado de interacción entre las subunidades. Basándose en suposiciones erróneas sobre la localización de los hemanos, optó por la incorrecta para describir la unión del oxígeno por la hemoglobina, suponiendo que la subunidad estuviera dispuesta en un cuadrado. La ecuación siguiente proporciona la ecuación para una estructura tetraédrica, que sería más precisa en el caso de la hemoglobina: Y ¯ = K + 3 α K 2 2 + 3 α 3 K 3 3 + α 6 K 4 4 1 + 4 K + 6 α K 2 2 + 4 α 3 K 3 3 + α 6 K 4 4 {\displaystyle {\bar {Y}}={\frac {K+3\alpha {}K^{2}^{2}+3\a alfa {}^{3}K^{3}^3}+\a alfa {}^{6}K^{4}^{4}}{1+4K+6\a alfa {}K^{2}^2}+4\a alfa {}^{3}K^{3}^{3}+\a alfa {}^{6}K^{4}^{4}}}}}
El modelo KNFEdit
Basado en los resultados que muestran que la estructura de las proteínas cooperativas cambia al unirse a su ligando, Daniel Koshland y sus colegas refinaron la explicación bioquímica del mecanismo descrito por Pauling. El modelo Koshland-Némethy-Filmer (KNF) supone que cada subunidad puede existir en una de dos conformaciones: activa o inactiva. La unión del ligando a una subunidad induciría un cambio conformacional inmediato de esa subunidad desde la conformación inactiva a la activa, un mecanismo descrito como “ajuste inducido”. La cooperatividad, según el modelo KNF, surgiría de las interacciones entre las subunidades, cuya fuerza varía en función de las conformaciones relativas de las subunidades implicadas. Para una estructura tetraédrica (también consideraron estructuras lineales y cuadradas), propusieron la siguiente fórmula
Y ¯ = K A B 3 ( K X K t ) + 3 K A B 4 K B B ( K X K t ) 2 + 3 K A B 3 K B B 3 ( K X K t ) 3 + K B B 6 ( K X K t ) 4 1 + 4 K A B 3 ( K X K t ) + 6 K A B 4 K B ( K X K t ) 2 + 4 K A B 3 K B B 3 ( K X K t ) 3 + K B B 6 ( K X K t ) 4 {\displaystyle {\bar {Y}}={\frac {K_{AB}^{3}(K_{X}K_{t})+3K_{AB}^{4}K_{BB}(K_{X}K_{t})^{2}+3K_{AB}^{3}K_{BB}^{3}(K_{X}K_{t})^{3}+K_{BB}^{6}(K_{X}K_{t})^{4}}{1+4K_{AB}^{3}(K_{X}K_{t})+6K_{AB}^{4}K_{BB}(K_{X}K_{t})^{2}+4K_{AB}^{3}K_{BB}^{3}(K_{X}K_{t})^{3}+K_{BB}^{6}(K_{X}K_{t})^{4}}}}
Donde K X {\displaystyle K_{X}}
es la constante de asociación para X, K t {\displaystyle K_{t}}
es la relación entre los estados B y A en ausencia de ligando (“transición”), K A B {\displaystyle K_{AB}}
y K B B {visualizar estilo K_{BB}}
son las estabilidades relativas de los pares de subunidades vecinas con respecto a un par en el que ambas subunidades están en el estado A. (Obsérvese que el documento KNF presenta en realidad N s {displaystyle N_{s}}
, el número de sitios ocupados, que es aquí 4 veces Y ¯ {displaystyle {\bar {Y}}
).
El modelo MWCEdit
El modelo Monod-Wyman-Changeux (MWC) para las transiciones alostéricas concertadas fue un paso más allá al explorar la cooperatividad basada en la termodinámica y las conformaciones tridimensionales. Se formuló originalmente para proteínas oligoméricas con subunidades idénticas dispuestas simétricamente, cada una de las cuales tiene un sitio de unión al ligando. Según este marco, dos (o más) estados conformacionales interconvertibles de una proteína alostérica coexisten en un equilibrio térmico. Los estados -a menudo denominados tenso (T) y relajado (R)- difieren en la afinidad por la molécula de ligando. La relación entre ambos estados está regulada por la unión de moléculas de ligando que estabilizan el estado de mayor afinidad. Es importante destacar que todas las subunidades de una molécula cambian de estado al mismo tiempo, un fenómeno conocido como “transición concertada”.
La constante de isomerización alostérica L describe el equilibrio entre ambos estados cuando no hay ninguna molécula de ligando unida: L = {\displaystyle L={frac {\left}{left}}
. Si L es muy grande, la mayor parte de la proteína existe en el estado T en ausencia de ligando. Si L es pequeño (cercano a uno), el estado R está casi tan poblado como el estado T. La relación de las constantes de disociación para el ligando de los estados T y R se describe mediante la constante c: c = K d R K d T {{displaystyle c={frac {K_{d}^{R}}{K_{d}^{T}}}}
. Si c = 1 {\displaystyle c=1}
, los estados R y T tienen la misma afinidad por el ligando y éste no afecta a la isomerización. El valor de c también indica cuánto cambia el equilibrio entre los estados T y R al unirse el ligando: cuanto más pequeño sea c, más se desplaza el equilibrio hacia el estado R después de una unión. Con α = K d R {\displaystyle \alpha ={frac {}{K_{d}^{R}}}}
, la ocupación fraccional se describe como Y ¯ = α ( 1 + α ) n – 1 + L c α ( 1 + c α ) n – 1 ( 1 + α ) n + L ( 1 + c α ) n {\displaystyle {\bar {Y}}={{frac {\alpha (1+\alpha )^{n-1}+Lc\alpha (1+c\alpha )^{n-1}{(1+\alpha )^{n}+L(1+c\alpha )^{n}}}}
El diagrama sigmoide de Hill de las proteínas alostéricas puede analizarse como una transición progresiva del estado T (baja afinidad) al estado R (alta afinidad) a medida que aumenta la saturación. La pendiente del diagrama de Hill también depende de la saturación, con un valor máximo en el punto de inflexión. Los interceptos entre las dos asíntotas y el eje y permiten determinar las afinidades de ambos estados por el ligando.
En las proteínas, el cambio conformacional se asocia a menudo con la actividad, o la actividad hacia objetivos específicos. Dicha actividad es a menudo lo que es fisiológicamente relevante o lo que se mide experimentalmente. El grado de cambio conformacional es descrito por la función de estado R ¯ {\displaystyle {\bar {R}}
, que denota la fracción de proteína presente en el estado R
state. Como ilustra el diagrama de energía, R ¯ {\displaystyle {\bar {R}}
aumenta a medida que se unen más moléculas de ligando. La expresión para R ¯ {\displaystyle {\bar {R}}
es: R ¯ = ( 1 + α ) n ( 1 + α ) n + L ( 1 + c α ) n {\displaystyle {\bar {R}}={frac {(1+\alpha )^{n}}(1+\alpha )^{n}+L(1+c\alpha )^{n}}}}
Un aspecto crucial del modelo MWC es que las curvas para Y ¯ {{displaystyle {\bar {Y}}
y R ¯ {visualizar estilo {barra {R}}
no coinciden, es decir, la saturación fraccional no es un indicador directo del estado conformacional (y, por tanto, de la actividad). Además, las magnitudes de la cooperatividad de la unión y la cooperatividad de la activación pueden ser muy diferentes: un caso extremo lo proporciona el motor de los flagelos de las bacterias con un coeficiente de Hill de 1,7 para la unión y 10,3 para la activación. La supra-linealidad de la respuesta se llama a veces ultrasensibilidad.
Si una proteína alostérica se une a una diana que también tiene una mayor afinidad por el estado R, entonces la unión de la diana estabiliza aún más el estado R, aumentando así la afinidad del ligando. Si, por el contrario, una diana se une preferentemente al estado T, la unión a la diana tendrá un efecto negativo sobre la afinidad del ligando. Estas dianas se denominan moduladores alostéricos.
Desde su creación, el marco del CMM se ha ampliado y generalizado. Se han propuesto variaciones, por ejemplo para atender a proteínas con más de dos estados, proteínas que se unen a varios tipos de ligandos o a varios tipos de moduladores alostéricos y proteínas con subunidades o sitios de unión a ligandos no idénticos.