Pokud jde o pěstování bakteriálních kolonií, nastupuje LB-agar – nejprve jej však musíte dostat do gelového stavu (což je situace, ke které se jeho přítel agaróza jistě vztahuje!) “-óza” je koncovka, která se obvykle používá k označení, že je něco cukr – a agaróza je cukr – ale agar také! Jaký je tedy rozdíl? Jsou příbuzné, ale liší se více než jen několika písmeny a díky těmto rozdílům jsou užitečné pro výrobu gelových matric pro různé úlohy – agarózové gely pro oddělování fragmentů DNA podle velikosti a agarové gelové desky pro pěstování bakterií)
Agar je věc podobná rybě a AGAR (alias agar-agar (vážně!)) je směs 2 cukrů – agaropectinu & toho, který známe spíše, agarózy. Takže agarózu získáte přečištěním agaru. A abychom pochopili, proč si s tím někdy dáte práci, ale jindy ne, pomůže vám vědět trochu víc o tom, co jsou tyto cukry zač.
Agarosa je polysacharid (“poly” znamená mnoho & sacharidových cukrů, takže polysacharid je dlouhý řetězec opakujících se cukerných podjednotek spojených dohromady). Je to příklad polymeru. Polymery jsou dlouhé řetězce opakujících se podjednotek. Různé polymery mají podjednotky různých typů (např. nukleotidové podjednotky se spojují a vytvářejí polymery, kterým říkáme DNA nebo RNA; aminokyseliny se spojují a vytvářejí bílkoviny; monosacharidové cukry se řetězí a vytvářejí složité sacharidy (např. agaróza!))
Cukry mají spoustu hydroxylových (-OH) skupin (na které se voda ochotně přilepí a pomůže vám vytvořit gel – “nekonečně” propojenou (jako 7° Kevinovy slaniny) polymerní síť obsahující vodu. (více v textu)). Jednotlivé cukerné jednotky (monosacharidy) často zaujímají kruhovou strukturu (jako je tomu v případě agarózy), v níž -OH skupiny trčí jako nohy. Cukry mohou mít stejnou “vazbu”, ale spojené skupiny mohou vyčnívat různými směry & používáme “L” a “D” pro označení toho, kterým směrem v prostoru nohy směřují. Více o takové stereochemii zde: bit.ly/2Q8Dnax
Monosacharidy mohou ke spojení používat své -OH. Spojením 2 vzniká disacharid . Přidejte několik dalších a získáte oligosacharidy (oligo znamená několik). Spojte jich hodně a získáte polysacharid (poly znamená mnoho).
A když už mluvíme o mnoha, více -OH znamená, že existuje více potenciálních vazebných míst (která určujeme podle toho, kolik “adres” na kruzích cukru se spojuje). Můžete získat “větvení”, ale v agaróze máte lineární řetězce (asi o 400 podjednotkách). (Ačkoli větvení lze zavést pomocí “zesíťovačů”, které agarosu zpevňují, aby se z ní daly dělat takové věci, jako je výroba pryskyřice pro velikostní vylučovací chromatografii (“gelovou filtraci”), která vydrží vysoké tlaky vznikající při FPLC (rychlé kapalinové chromatografii).
V agarose je opakující se podjednotkou dvojice cukrů (disacharid) galaktózy (přesněji D-galaktózy) spojená s modifikovaným monosacharidem galaktózy, 3,6-anhydro-L-galaktózou. Toto duo nazýváme AGAROBIOSE (Spojením galaktózy s glukózou získáme laktózu, disacharid, který možná znáte lépe).
V galaktóze mají kruhy 6 stran se 4 -OH rameny, 5 -H rameny, & 1 methylhydroxylové (-CH₂OH) rameno. Nohy “-H” často nekreslíme, protože skrývají zajímavější nohy, které jsou schopné reagovat. V modifikované galaktóze agarózy se 2 skupiny -OH spojily & vykopaly vodík (“anhydro”), takže methylhydroxylové rameno je přemostěno na rameno -OH a tvoří “most” přes kruh.
Přibližně 2/3 agarózy tvoří agaróza, ale agar obsahuje také AGAROPECTIN. Je opravdu podobný (má střídavé D & L galaktózy), ALE mnoho z těchto galaktóz má modifikace. Existuje několik různých modifikací, včetně přidání sulfátu (sulfátů), kyseliny pyrohroznové nebo methylových skupin, nebo vpašování jedné z těch verzí se spojenou nohou, jako je tomu u agarózy.
Na rozdíl od konzistentní opakující se povahy AGARÓZY je u agaropektinu konzistentní pouze střídavá D- & L galaktózová “kostra”. Jeho modifikace jsou rozptýleny po celém řetězci (například ~každá desátá je připojena k sulfátu prostřednictvím -O-sulfátové vazby, ale to je jen v průměru a není pravděpodobné, že by byly přesně, rovnoměrně, rozloženy). A zatímco řetězce mají tendenci být kratší než řetězce agarosy, jejich délka je také proměnlivá, takže agaropectin je opravdu docela směs & nikdy nevíte, co přesně dostanete!”
Proč používat jeden místo druhého?
DNA má hodně záporně nabitých fosfátových skupin (fosfor obklopený 4 oxygeny). To poslouží jako základ pro jejich pohyb gelem směrem ke kladnému konci. Potřebujeme tedy, aby byl gel neutrální.
Agar má hodně sulfátových skupin (síra obklopená oxygeny). Ty jsou také záporně nabité, takže mohou narušovat pohyb DNA v gelu. Proto by byla špatnou matricí pro elektroforézu.
Agaróza je neutrální, takže je dobrou matricí pro elektroforézu.
Agaróza je také dražší, protože se musí čistit. Takže pokud si nemusíte dělat starosti s problémem fyzikálního náboje, můžete rovnou použít něco, co má nižší *monetární* náboj! Protože agar vyžaduje méně zpracování, je levnější & ideální pro použití jako matrice pro udržení potravy pro bakterie!
V agarových destičkách to není samotný agar, který poskytuje živiny. To je jedna ze skvělých vlastností agaru – *většina* bakterií ho nemůže jíst. Místo toho agar pouze poskytuje “lešení” pro umístění živin, které bakterie potřebují. A tyto živiny jsou často poskytovány prostřednictvím tekutého “růstového média” pro bakterie zvaného LB, což bez ohledu na to, co se píše v učebnicích, (přinejmenším původně) znamená Lysogeny Broth. Někdy se tento název připisuje iniciálám Luria, Lennox nebo Luria & Bertani, ale ve skutečnosti znamená LYSOGENY BROTH a jeho recept byl poprvé zveřejněn (Giuseppe Bertani) v roce 1951. Používal ho při studiu lyzogeneze (proces, při kterém bakterie infikující virus zvaný bakteriofág (“fág”) vkládá svou vlastní DNA do DNA bakterie & vyčkává, dokud nenastanou vhodné podmínky pro vstup lytického fága, kde se vyřízne, vytvoří spoustu kopií a protrhne buňku) http://bit.ly/2HLuB1S
Smyslem LB je v podstatě dát bakteriím to, co potřebují, aby mohly růst, dělit se a dělat to, co chceme (například vytvářet kopie DNA, kterou jsme do nich vložili, a/nebo vytvářet kopie proteinů pomocí instrukcí z DNA, kterou jsme do nich vložili). A aby to bylo levné.
Poznámka: Pro tvorbu proteinů a DNA ve velkém měřítku pěstujeme bakterie v přímé LB tekutině – “v suspenzi” s protřepáváním – ale když potřebujeme izolovat specifické skupiny bakterií, které jsou všechny odvozeny ze stejné “mateřské buňky”, a tedy geneticky identické, vložíme tuto LB do gelu, aby se různé geneticky odlišné “kolonie” nemíchaly, ale rostly jako lepkavé tečky. Pokud se chcete dozvědět více o různých médiích pro suspenzní materiál, podívejte se na tento příspěvek http://bit.ly/bacterialmedia, ale dnes se zaměřím na gelovou formu.
Bakteriím nedáváme pětihvězdičkovou kuchyni. Místo toho chceme utratit co nejméně peněz a přitom jim poskytnout živiny, které potřebují. Minimálně jim musíme poskytnout zdroj energie, něco, co mohou rozložit (katabolizovat) a vytvořit ATP – takovými věcmi mohou být cukry, bílkoviny, tuky. Kromě toho, aby mohly věci rozkládat, musí být schopny vytvářet věci, jako jsou bílkoviny a DNA (provádět anabolickou část metabolismu). K tomu jsou zapotřebí živiny, které poskytují potřebné prvky, jako je uhlík a dusík, které naštěstí můžete získat pomocí jednoduchého receptu, který postačí mnoha bakteriím.
Jsou zde 3 hlavní složky (i když 2 z těchto složek mají samy o sobě hodně komponent.
- TRYPTON -> jedná se o směs peptidů vzniklých trávením bílkoviny zvané kasein pomocí enzymu slinivky břišní -> to poskytuje aminokyseliny, které mohou bakterie využít k tvorbě nových bílkovin
- EXTRAKT Z KVASNIC -> tento “autolyzát” z kvasnic je v podstatě jen to, co se v kvasnicích náhodou vyskytlo (organické sloučeniny včetně vitamínů, stopových prvků atd.) – a pokud to kvasinkám stačilo…
- CHLORID SODNÝ (NaCl) (kuchyňská sůl) -> umožňuje osmotickou rovnováhu, transport atd.
Několik hlavních přípravků LB jsou verze “Miller”, “Lennox”, & “Luria” & liší se množstvím soli, kterou mají. Miller & Bertani topí bakterie v NaCl (10 g/l), zatímco Lennox používá jen 5 g/l a Luria jen 0,5 g/l -> takové recepty s nízkým obsahem soli jsou dobré, pokud používáte antibiotikum citlivé na sůl. v původní práci Bertani přidával také glukózu, ale většina pozdějších receptů ji vynechává.
A když už mluvíme o vynechávání, musíme se ujistit, že “vynecháme” bakterie, které nechceme, což můžeme udělat “výběrem” bakterií, které chceme, pomocí selekčních médií, která obsahují věci jako antibiotika atd. potlačující růst věcí, které nechceme, aby rostly. Když například vkládáme geny do bakterií, děláme to obvykle ve formě kruhových kousků DNA zvaných plazmidy. Tyto plazmidy navrhujeme tak, aby obsahovaly také gen rezistence vůči antibiotikům, takže můžeme potravu tímto antibiotikem okořenit a ona může stále růst, ale jiné věci ne http://bit.ly/2tcW4ky
Existují také diferenciální média – ta umožňují “screening” na rozdíl od “selekce” – nebráníte věcem v růstu, ale měníte jejich vzhled – např, používáme X-gal pro modrobílý screening http://bit.ly/2MxNPs2
Poté, co vložím plazmid s mým genem do bakterií a získám kolonie, vyberu několik těchto kolonií a dám je do tekutého LB (s antibiotikem) růst přes noc, aby se vytvořilo mnoho kopií plazmidu, pak mohu tyto kopie vyčistit a poslat je na sekvenování, abych zkontroloval překlepy, než vstoupím do části “příprava exprese”.
Nezáleží na tom, jaké médium použijete, musí být sterilní. Takže je autoklávuješ (strčíš je do opravdu horké vysokotlaké myčky) -> dbej na to, aby lahvičky nebyly těsně uzavřeny, jinak explodují (naštěstí jsem tuto chybu neudělal) – a víčka znovu neutahuj, dokud lahvičky nevychladnou, jinak se víčka zaseknou (to jsem *udělal*). Další chyba, kterou nesmíte udělat -> nepřidávejte antibiotika před autoklávováním, jinak je inaktivujete. My je obvykle přidáváme až těsně před použitím.
Na bakalářském stupni jsem si všechna média vyráběl sám, ale tady jich používáme tolik, že máme “media-maker” laborantku, která je úžasná a vyrábí & sterilizuje nám média pro růst bakterií. Poznáte, že něco prošlo autoklávem, když jsou čáry na jeho autoklávovací pásce černé – páska je citlivá na teplotu, takže když se hodně zahřeje, změní barvu. Opravdu chci navrhnout řadu autoklávových pásek s vtipnými a/nebo zajímavými zprávami – takže kdyby celá ta výuka nevyšla, myslím, že mám záložní řešení!
další zmíněná témata (&ostatní) #365DaysOfScience Vše (s uvedenými tématy) 👉 http://bit.ly/2OllAB0
.
