Ha baktériumtelepek tenyésztéséről van szó, az LB-agar lép a lemezre – de előbb géles állapotba kell hozni (amihez barátja, az agaróz biztosan tud viszonyulni!) Az “-óz” végződés általában arra utal, hogy valami cukor – és az agaróz cukor – de az agar is az! Mi tehát a különbség? Rokonok, de nem csak néhány betűben különböznek, és ezek a különbségek teszik őket hasznossá a különböző feladatokhoz szükséges gélmátrixok készítéséhez – agaróz gélek a DNS fragmentumok méret szerinti szétválasztásához és agar géllemezek a baktériumok tenyésztéséhez)
A gar egy halszerű dolog, az AGAR (más néven agar-agar (komolyan!)) pedig 2 cukor keveréke – az agaropektin & az általunk jobban ismert agaróz. Tehát az agar tisztításával agarózt kapsz. És ahhoz, hogy megértsük, hogy miért veszed ezt a fáradságot néha, máskor meg nem, segít egy kicsit többet tudni arról, hogy mik ezek a cukrok.
Az agaróz egy poliszacharid (“poli” azt jelenti, hogy sok & szacharid cukor, tehát a poliszacharid egy hosszú láncban egymáshoz kapcsolódó, ismétlődő cukor alegységek). Ez egy példa a polimerre. A polimerek ismétlődő alegységek hosszú láncai. A különböző polimerek különböző típusú alegységekből állnak (pl. a nukleotid alegységek összekapcsolódva adják a DNS-nek vagy RNS-nek nevezett polimereket; az aminosavak fehérjéket alkotnak; és a monoszacharid cukrok láncszerűen összekapcsolódva adják az összetett szénhidrátokat (mint például az agaróz!))
A cukroknak sok hidroxil (-OH) csoportjuk van (amelyekhez a víz szívesen tapad, segítve ezzel a gél – egy “végtelenül” összekapcsolt (mint a 7°-os Kevin szalonna), vizet tartalmazó polimerháló – kialakulását. (továbbiak következnek)). Az egyes cukoregységek (monoszacharidok) gyakran gyűrűs szerkezetet vesznek fel (mint például az agarózban), amelyben a -OH csoportok lábaiként állnak ki. A cukroknak lehet ugyanaz a “kötésük”, de a kapcsolt csoportok különböző módon állnak ki & az “L” és “D” jelzőt használjuk arra, hogy a térben a lábak melyik irányba mutatnak. Az ilyen sztereokémiáról bővebben itt: bit.ly/2Q8Dnax
A monoszacharidok a -OH-jukat használhatják egymáshoz kapcsolódáshoz. Ha 2-t kapcsolunk össze, akkor egy diszacharidot kapunk . Ha hozzáadunk még néhányat, akkor oligoszacharidokat kapunk (az oligo azt jelenti, hogy kevés). Ha sokat kapcsolunk össze, akkor poliszacharidot kapunk (a poli sokat jelent).
És ha már a soknál tartunk, a több -OH azt jelenti, hogy több lehetséges kapcsolódási hely van (amit azzal határozunk meg, hogy a cukorgyűrűk hányadik “címét” kapcsoljuk össze). Lehet “elágazás”, de az agarózban lineáris láncok vannak (kb. 400 alegységből). (Bár az elágazásokat “térhálósítókkal” be lehet vezetni az agaróz megerősítésére, hogy olyan dolgokra is alkalmas legyen, mint a méretkizáró kromatográfiás (“gélszűrő”) gyanta, amely ellenáll az FPLC (gyors teljesítményű folyadékkromatográfia) során keletkező nagy nyomásnak.
Az agarózban az ismétlődő alegység egy cukorpár (diszacharid) galaktóz (pontosabban D-galaktóz), amely egy módosított galaktóz monoszacharidhoz, a 3,6-anhidro-L-galaktózhoz kapcsolódik. Ezt a duót AGAROBIOSZ-nak nevezzük (egy galaktóz és egy glükóz összekapcsolásával kapjuk a laktózt, egy diszacharidot, amit talán jobban ismerünk).
A galaktózban a gyűrűknek 6 oldala van, 4 -OH láb, 5 -H láb, & 1 metilhidroxil (-CH₂OH) láb. A “-H” lábakat gyakran nem rajzoljuk meg, mert elrejtik az érdekesebb, reakcióképes lábakat. Az agaróz módosított galaktózában a 2 -OH csoportból 2 összekapcsolódott & kirúgott egy hidrogént (“anhidro”), így a metil-hidroxil kar egy -OH karral hidat képezve “hidat” képez a gyűrű felett.
Az agar kb. 2/3-a agaróz, de, az agar tartalmaz AGAROPECTIN-t is. Ez valóban hasonló (váltakozó D & L galaktózok vannak benne), DE sok ilyen galaktóznak vannak módosításai. Számos különböző módosítás létezik, beleértve a szulfát(ok), a piroszőlősav vagy metilcsoportok hozzáadását, vagy az agarózhoz hasonló, összekapcsolt lábú változatok egyikének becsempészését.
Az AGAROSZ következetes ismétlődő jellegével ellentétben az agaropektinben csak a váltakozó D- & L- galaktóz “váz” következetes. A módosításai szétszóródnak a láncban (pl. ~minden 10. szulfáthoz -O-szulfát kötésen keresztül kapcsolódik egy szulfát, de ez csak átlag, és nem valószínű, hogy pontosan, egyenletesen, eloszlanak). És, bár a láncok általában rövidebbek, mint az agaróz láncok, a hosszuk is változó, így az agaropektin tényleg eléggé vegyes & sosem tudhatod pontosan, hogy mit fogsz kapni!
Miért használod az egyiket a másik helyett?
A DNS-nek sok negatív töltésű foszfátcsoportja van (4 oxigénnel körülvett foszfor). Ez szolgál alapjául, hogy a gélen keresztül a pozitív vég felé mozogjanak. Tehát arra van szükségünk, hogy a gél semleges legyen.
Agarnak sok szulfátcsoportja van (oxigénekkel körülvett kén). Ezek szintén negatív töltésűek, így zavarhatják a DNS gélen való mozgását. Így tehát rossz mátrix lenne az elektroforézishez.
De az agaróz semleges, így jó mátrix az elektroforézishez.
De az agaróz drágább is, mert tisztítani kell. Tehát ha nem kell aggódnod a fizikai töltés kérdése miatt, akkor akár használhatsz olyat is, aminek alacsonyabb *monetáris* töltése van! Mivel az agar kevesebb feldolgozást igényel, olcsóbb & tökéletesen használható mátrixként a baktériumok táplálékának megtartására!.
Az agar lemezeken nem maga az agar biztosítja a tápanyagokat. Ez az egyik nagyszerű dolog az agarban – *a legtöbb* baktérium nem tudja megenni. Ehelyett az agar csak “állványzatot” biztosít a baktériumoknak szükséges tápanyagoknak. És gyakran ezeket a tápanyagokat egy LB nevű folyékony baktériumtáp “növekedési közeg” biztosítja, amely, bármit is mondanak a tankönyvek, (eredetileg legalábbis) a Lysogeny Broth (lizogénleves) rövidítése. Néha a Luria, Lennox vagy Luria & Bertani kezdőbetűi kapják a nevet, de valójában a LYSOGENY BROTH rövidítése, és a receptjét először 1951-ben publikálta (Giuseppe Bertani). Ő a lizogénia tanulmányozásakor használta (egy olyan folyamat, amelyben egy baktérium-fágnak (“fág”) nevezett baktérium-fertőző vírus saját DNS-ét illeszti be egy baktérium DNS-ébe & kivárja az időt, amíg a feltételek megfelelőek lesznek a lizogén fág belépéséhez, ahol kivágja magát, sok másolatot készít, és felrobbantja a sejtet) http://bit.ly/2HLuB1S
A LB lényege alapvetően az, hogy megadjuk a baktériumoknak, amire szükségük van ahhoz, hogy növekedjenek, osztódjanak, és azt tegyék, amit mi akarunk (például másolatot készítsenek az általunk beléjük helyezett DNS-ről és/vagy fehérjék másolatát az általunk beléjük helyezett DNS utasításai alapján). És hogy mindezt olcsón tegyük.
Megjegyzés: A fehérjekészítéshez és a nagyszabású DNS-készítéshez a baktériumokat egyenesen LB folyadékban neveljük – “szuszpenzióban”, rázással -, de amikor specifikus baktériumcsoportokat kell izolálnunk, amelyek mind ugyanabból az “anyasejtből” származnak, és így genetikailag azonosak, akkor az LB-t gélbe ágyazzuk, hogy a különböző genetikailag elkülönülő “telepek” ne keveredjenek egymással, hanem gloopy pontokként növekedjenek. Ha többet szeretnél megtudni a szuszpenziós cuccok különböző táptalajairól, nézd meg ezt a bejegyzést http://bit.ly/bacterialmedia, de ma a gélbe zárt formára fogok koncentrálni.
Nem adunk a baktériumoknak 5 csillagos konyhát. Ehelyett a lehető legkevesebb pénzt akarjuk költeni, miközben megadjuk nekik a szükséges tápanyagokat. Legalább egy energiaforrást kell adnunk nekik, valamit, amit le tudnak bontani (katabolizálni), hogy ATP-t állítsanak elő – ilyenek lehetnek cukrok, fehérjék, zsírok. A lebontás mellett képesnek kell lenniük olyan dolgok előállítására is, mint a fehérjék és a DNS (az anyagcsere anabolikus része). Ehhez olyan tápanyagokra van szükség, amelyek biztosítják a szükséges elemeket, mint a szén és a nitrogén, amit szerencsére egy egyszerű, sok baktérium számára elegendő recepttel meg lehet szerezni.
3 fő komponens van (bár ezek közül 2 komponensnek önmagában is sok összetevője van.
- TRYPTON -> ez egy peptidek keveréke, amely a kazein nevű fehérje hasnyálmirigy enzimmel történő emésztése során keletkezik -> ez aminosavakat biztosít, amelyeket a baktériumok új fehérjék előállítására használhatnak
- Élesztő kivonat -> ez az élesztő “autolízise” lényegében csak minden, ami az élesztőben volt (szerves vegyületek, beleértve vitaminokat, nyomelemeket, stb.) – és ha ez elég jó volt az élesztőnek…
- NÁTRIUM-KLORID (NaCl) (konyhasó) -> lehetővé teszi az ozmotikus egyensúlyt, a szállítást stb.
A főbb LB készítmények közül néhány: “Miller”, “Lennox”, & “Luria” változat & ezek a só mennyiségében különböznek. Miller & Bertani NaCl-ba fojtja a baktériumokat (10g/L), míg Lennox csak 5g/L-t, Luria pedig csak 0,5g/L-t használ -> az ilyen alacsony só tartalmú receptek akkor jók, ha sóérzékeny antibiotikumot használunk. az eredeti dolgozatban Bertani glükózt is adott hozzá, de a legtöbb későbbi recept elhagyja.
És ha már a kihagyásnál tartunk, meg kell győződnünk arról, hogy “kihagyjuk” a nem kívánt baktériumokat, amit úgy tehetünk meg, hogy a kívánt baktériumokat “szelektáljuk” szelekciós táptalajok segítségével, amelyek olyan dolgokat tartalmaznak, mint az antibiotikumok stb. amelyek elnyomják a nem kívánt dolgok növekedését. Amikor például géneket juttatunk a baktériumokba, azt általában kör alakú DNS-darabok, úgynevezett plazmidok formájában tesszük. Ezeket a plazmidokat úgy tervezzük meg, hogy egy antibiotikum-rezisztencia gént is tartalmazzanak, így megspékelhetjük az élelmiszert ezzel az antibiotikummal, és az még mindig növekedhet, de más dolgok nem http://bit.ly/2tcW4ky
Léteznek differenciált közegek is – ez lehetővé teszi a “szűrést” a “szelekcióval” szemben – nem akadályozzuk meg a dolgok növekedését, de megváltoztatjuk a megjelenésüket – például, X-gal-t használunk a kék-fehér szűréshez http://bit.ly/2MxNPs2
Miután a génemet tartalmazó plazmidot baktériumokba helyezem, és kolóniákat kapok, kiválasztok néhányat ezekből a kolóniákból, és folyékony LB-be teszem őket (antibiotikummal), hogy egy éjszakán át növekedjenek, hogy a plazmidból sok másolatot készítsenek, majd kitisztíthatom ezeket a másolatokat, és elküldhetem őket szekvenálásra, hogy ellenőrizzem a gépelési hibákat, mielőtt belépek az “expression prep” részbe.
Függetlenül attól, hogy milyen táptalajt használsz, sterilnek kell lennie. Tehát autoklávozod (bedugod egy nagyon forró, nagynyomású mosogatógépbe) -> ügyelj arra, hogy a palackok ne legyenek szorosan lezárva, különben felrobban (szerencsére ezt a hibát még nem követtem el) – és ne húzd vissza a fedeleket, amíg a palackok ki nem hűlnek, különben a fedelek beragadnak (ezt *már* elkövettem). Egy másik hiba, amit nem szabad elkövetni -> ne adjunk hozzá antibiotikumot az autoklávozás előtt, különben inaktiváljuk őket. Mi általában csak közvetlenül a felhasználás előtt szoktuk hozzáadni.
Az egyetemen minden táptalajt magam készítettem, de itt olyan sokat használunk belőle, hogy van egy “médiakészítő” laboránsunk, aki elképesztő, és & sterilizálja a baktériumtenyésztő táptalajunkat. Tudod, hogy valami átment egy autoklavon, ha a vonalak az autokláv szalagján feketék – a szalag hőmérséklet-érzékeny, így a színe megváltozik, amikor nagyon forró lesz. Nagyon szeretnék egy sor viccet és/vagy triviális üzenetet tartalmazó autokláv szalagot tervezni – így ha az egész tanítási dolog nem jönne össze, azt hiszem, van egy tartalékom!
többet az említett témákról (& mások) #365DaysOfScience Minden (a felsorolt témákkal) 👉 http://bit.ly/2OllAB0
