När det gäller att odla bakteriekolonier, LB-agar tar steget upp till plattan – men först måste du få det i ett geltillstånd (en situation som dess vän agarose säkert kan relatera till!) “-ose” är en ändelse som vanligtvis används för att ange att något är ett socker – och agaros är ett socker – men det är agar också! Så vad är skillnaden? De är besläktade, men de skiljer sig åt med mer än bara några bokstäver och dessa skillnader gör dem användbara för att göra gelmatriser för olika uppgifter – agarosgeler för att separera DNA-fragment efter storlek och agargelplattor för odling av bakterier)
En gar är en fiskliknande sak och AGAR (även kallad agar-agar (seriöst!)) är en blandning av två sockerarter – agaropektin & den som vi är mer bekanta med, agaros. Man får alltså agaros genom att rena agar. Och för att förstå varför man ibland går igenom det besväret, men inte andra gånger, hjälper det att veta lite mer om vad dessa sockerarter är.
Agaros är en polysackarid (“poly” betyder många & sockerarter, så en polysackarid är en lång kedja av upprepade sockerunderenheter som är sammanfogade). Det är ett exempel på en polymer. Polymerer är långa kedjor av upprepade underenheter. Olika polymerer har underenheter av olika typer (t.ex. nukleotidunderenheter kopplas samman för att ge de polymerer som vi kallar DNA eller RNA, aminosyror förenas för att bilda proteiner och monosackaridsocker kedjesammansätts för att ge komplexa kolhydrater (som agaros!).))
Socker har många hydroxylgrupper (-OH) (som vatten gärna fastnar på, vilket hjälper dig att bilda en gel – ett “oändligt” sammankopplat (som 7° Kevin bacon) polymernät som innehåller vatten. (mer kommer senare)). Enskilda sockerenheter (monosackarider) antar ofta ringstrukturer (som i agaros) där -OH-grupperna sticker ut som ben. Sockerarter kan ha samma “koppling” men ha de kopplade grupperna som sticker ut på olika sätt & vi använder “L” och “D” för att hänvisa till vilken riktning i rummet benen pekar. Mer om sådan stereokemi här: bit.ly/2Q8Dnax
Monosackarider kan använda sina -OH:er för att länka samman. Genom att länka två ger man en disackarid . Lägger man till några fler får man oligosackarider (oligo betyder få). Länka många och du får en polysackarid (poly betyder många).
Och på tal om många innebär de många -OH:erna att det finns flera potentiella länkningsställen (som vi specificerar genom vilket antal “adresser” på sockerringarna som kopplas samman). Man kan få “förgreningar”, men i agaros har man linjära kedjor (av cirka 400 underenheter). (Även om förgreningar kan införas med hjälp av “tvärbindare” för att förstärka agaros så att den kan göra saker som att göra storleksexkluderingskromatografi (“gelfiltrering”) av harts som klarar de höga tryck som genereras i FPLC (Fast performance liquid chromatography).
I agaros är den repeterande underenheten en sockerduo (disackarid) av galaktos (D-galaktos för att vara exakt) som är kopplad till en modifierad galaktosmonosackarid, 3,6-anhydro-L-galaktos. Vi kallar denna duo för AGAROBIOSE (om man kopplar en galaktos till en glukos får man laktos, en disackarid som du kanske är mer bekant med).
I galaktos har ringarna 6 sidor med 4 -OH-ben, 5 -H-ben, & 1 metylhydroxyl (-CH₂OH)-ben. Vi ritar ofta inte “-H”-benen eftersom de döljer de mer intressanta benen som kan reagera. I agarosens modifierade galaktos har 2 av -OH-grupperna länkats samman & sparkat ut ett väte (“anhydro”) så att metylhydroxylarmen är bryggad till en -OH-arm som bildar en “bro” över ringen.
Omkring 2/3 av agar är agaros, men, agar innehåller också AGAROPECTIN. Det är mycket likt (det har alternerande D & L-galaktoser) MEN många av dessa galaktoser har modifieringar. Det finns flera olika modifieringar, bland annat genom att lägga till sulfat(er), pyruvsyra eller metylgrupper, eller genom att smyga in en sådan länkad version som finns i agaros.
I motsats till den konsekventa repetitiva karaktären hos AGAROSE är det bara det alternerande D- & L-galaktos-“skelettet” som är konsekvent i agaropektin. Dess modifieringar är utspridda i hela kedjan (till exempel är ~ var tionde kopplad till en sulfat genom en -O-sulfatlänkning, men det är bara i genomsnitt, och det är inte troligt att de är exakt, jämnt fördelade). Och även om kedjorna tenderar att vara kortare än agarosekedjorna är deras längd också varierande, så agaropektin är verkligen en hel blandning & man vet aldrig riktigt vad man får!
Varför använda det ena framför det andra?
DNA har många negativt laddade fosfatgrupper (fosfor omgiven av 4 oxygener). Detta kommer att tjäna som grund för att de ska röra sig genom gelen mot den positiva änden. Vi behöver alltså en neutral gel.
Agar har många sulfatgrupper (svavel omgiven av oxygener). Dessa är också negativt laddade, så de kan störa hur DNA rör sig genom gelen. Det skulle alltså utgöra en dålig matris för elektrofores.
Men agaros är neutralt, vilket gör det till en bra matris för elektrofores.
Men agaros är också dyrare eftersom det måste renas. Så om man inte behöver oroa sig för frågan om fysisk laddning kan man lika gärna använda något som har en lägre *monetär* laddning! Eftersom agar kräver mindre bearbetning är den billigare & perfekt för användning som en matris för att hålla bakteriernas föda!.
I agarplattor är det inte agaren i sig själv som ger näring. Det är en av de fantastiska sakerna med agar – *de flesta* bakterier kan inte äta den. Istället ger agaren bara “byggnadsställningar” för att hysa de näringsämnen som bakterierna behöver. Ofta tillhandahålls dessa näringsämnen genom ett flytande “tillväxtmedium” för bakterieföda som kallas LB, vilket, oavsett vad som står i läroböckerna, (åtminstone ursprungligen) står för Lysogeny Broth (Lysogeny Broth). Ibland får initialer för Luria, Lennox eller Luria & Bertani erkännande för namnet, men det står egentligen för LYSOGENY BROTH och receptet publicerades första gången (av Giuseppe Bertani) 1951. Han använde det när han studerade lysogeni (en process där ett bakterieinfekterande virus som kallas bakteriofag (“fage”) infogar sitt eget DNA i en bakteries DNA & och väntar tills förhållandena är de rätta för att komma in i den lytiska fagen där den skär ut sig själv, gör många kopior och spränger cellen) http://bit.ly/2HLuB1S
Punkten med LB är i princip att ge bakterierna vad de behöver för att växa, dela sig och göra det vi vill (som att göra kopior av DNA som vi sätter in i dem och/eller göra kopior av proteiner med hjälp av instruktioner från DNA som vi sätter in i dem). Och att göra det billigt.
Notera: För proteintillverkning och DNA-tillverkning i stor skala odlar vi bakterier i ren LB-vätska – “i suspension” med skakning – men när vi behöver isolera specifika grupper av bakterier som alla härstammar från samma “föräldracell” och därmed är genetiskt identiska, bäddar vi in denna LB i en gel så att olika genetiskt distinkta “kolonier” inte blandar sig med varandra utan i stället växer som kladdiga prickar. Om du vill lära dig mer om olika medier för suspensionsgrejerna kan du läsa det här inlägget http://bit.ly/bacterialmedia men i dag ska jag fokusera på den gelinfällda formen.
Vi ger inte bakterierna något 5-stjärnigt kök. Istället vill vi spendera så lite pengar som möjligt samtidigt som vi ger dem de näringsämnen de behöver. Som ett minimum måste vi ge dem en energikälla, något som de kan bryta ner (katabolisera) för att göra ATP – sådana saker kan vara sockerarter, proteiner, fetter. Förutom att bryta ner saker måste de kunna tillverka saker som proteiner och DNA (göra den anabola delen av ämnesomsättningen). Detta kräver näringsämnen som tillhandahåller de element som behövs som kol och kväve, vilket du tack och lov kan få med ett enkelt recept som är tillräckligt för många bakterier.
Det finns 3 huvudkomponenter (även om 2 av dessa komponenter själva har många komponenter.
- TRYPTONE -> detta är en blandning av peptider som bildas genom att ett protein som kallas kasein smälts ner med bukspottkörtelns enzym -> detta ger aminosyror som bakterierna kan använda för att tillverka nya proteiner
- GJÄST EXTRAKT -> detta “autolysat” av jäst är i princip bara det som råkade finnas i jästen (organiska föreningar, inklusive vitaminer, spårämnen, osv.) – och om det var tillräckligt bra för jästen…
- Natriumklorid (NaCl) (bordssalt) -> möjliggör osmotisk balans, transport osv.
Några av de större LB-formuleringarna är “Miller”, “Lennox”, & “Luria”-versionerna & de skiljer sig åt i den mängd salt de har. Miller & Bertani dränker bakterierna i NaCl (10g/L) medan Lennox bara använder 5g/L och Luria bara 0,5g/L -> sådana recept med låg salthalt är bra om man använder ett saltkänsligt antibiotikum. i originalhandlingen tillsatte Bertani också glukos, men de flesta senare recept utelämnar det.
Och på tal om att utelämna saker måste vi se till att vi “utelämnar” bakterier som vi inte vill ha, vilket vi kan göra genom att “selektera för” de bakterier som vi vill ha med hjälp av selektionsmedier, som innehåller saker som antibiotika etc. som undertrycker tillväxten av sådant som man inte vill ska växa. När vi till exempel lägger in gener i bakterier gör vi det normalt i form av cirkulära DNA-bitar som kallas plasmider. Vi utformar dessa plasmider så att de också har en gen för antibiotikaresistens, så att vi kan spetsa maten med det antibiotikumet och den kan fortfarande växa, men andra saker kan inte växa http://bit.ly/2tcW4ky
Det finns också differentiella medier – detta gör det möjligt att “screena” i motsats till “selektera” – man hindrar inte saker från att växa, men man ändrar hur de ser ut – till exempel, Vi använder X-gal för blå-vit screening http://bit.ly/2MxNPs2
När jag sätter en plasmid med min gen i bakterier och får kolonier väljer jag ut några av dessa kolonier och sätter dem i flytande LB (med antibiotika) för att växa över natten för att göra många kopior av plasmiden, sedan kan jag rena dessa kopior och skicka dem för sekvensering för att kontrollera om det är några stavfel innan jag går in i “expressionsförberedelse”-delen.
Oavsett vilket medium du använder måste det vara sterilt. Så du autoklaverar det (stoppar det i en riktigt varm diskmaskin med högt tryck) -> ser till att flaskorna inte är tätt förseglade, annars exploderar de (tack och lov har jag inte gjort detta misstag) – och drar inte åt locken igen förrän flaskorna har svalnat, annars fastnar locken (jag *har* gjort detta misstag). Ett annat misstag att inte göra -> tillsätt inte antibiotika innan autoklavering, annars inaktiverar du dem. Vi brukar inte tillsätta det förrän precis innan vi ska använda det.
I grundutbildningen gjorde jag alla mina egna medier, men här använder vi så mycket av dem att vi har en laboratorietekniker som är fantastisk och gör & steriliserar våra bakterietillväxtmedier. Du vet att något har gått igenom en autoklav om linjerna på autoklavtejpen är svarta – tejpen är temperaturkänslig så den ändrar färg när den blir riktigt varm. Jag vill verkligen utforma en serie autoklavtejp med skämt och/eller triviala budskap – så om hela undervisningsgrejen inte fungerar, har jag väl en reservlösning!
mer om nämnda ämnen (& andra) #365DaysOfScience Alla (med listade ämnen) 👉 http://bit.ly/2OllAB0
