Wenn es darum geht, Bakterienkolonien zu züchten, kommt LB-Agar auf die Platte – aber zuerst muss man es in einen Gelzustand bringen (eine Situation, auf die sich sein Freund Agarose sicher beziehen kann!) “-ose” ist eine Endung, die normalerweise verwendet wird, um anzuzeigen, dass etwas ein Zucker ist – und Agarose ist ein Zucker – aber Agar ist es auch! Worin liegt also der Unterschied? Sie sind verwandt, aber sie unterscheiden sich durch mehr als nur ein paar Buchstaben, und diese Unterschiede machen sie nützlich für die Herstellung von Gelmatrizen für verschiedene Aufgaben – Agarosegele für die Trennung von DNA-Fragmenten nach Größe und Agargelplatten für das Züchten von Bakterien)
Ein Gar ist ein fischähnliches Ding und AGAR (auch bekannt als Agar-Agar (ernsthaft!)) ist eine Mischung aus zwei Zuckern – Agaropektin & und dem uns bekannteren Agarose. Man erhält also Agarose, indem man Agar reinigt. Und um zu verstehen, warum man sich manchmal diese Mühe macht, manchmal aber auch nicht, ist es hilfreich, ein bisschen mehr über diese Zucker zu wissen.
Agarose ist ein Polysaccharid (“Poly” bedeutet viele & Saccharid-Zucker, ein Polysaccharid ist also eine lange Kette von sich wiederholenden Zuckeruntereinheiten, die miteinander verbunden sind). Es ist ein Beispiel für ein Polymer. Polymere sind lange Ketten von sich wiederholenden Untereinheiten. Verschiedene Polymere haben Untereinheiten unterschiedlicher Art (z. B. verbinden sich Nukleotid-Untereinheiten zu den Polymeren, die wir DNA oder RNA nennen; Aminosäuren verbinden sich zu Proteinen; und Monosaccharid-Zucker verketten sich zu komplexen Kohlenhydraten (wie Agarose!))
Zucker haben viele Hydroxyl (-OH)-Gruppen (an denen Wasser gerne haftet, wodurch ein Gel entsteht – ein “unendlich” vernetztes (wie 7° von Kevin Bacon) Polymernetz, das Wasser enthält. (mehr dazu später)). Einzelne Zuckereinheiten (Monosaccharide) nehmen oft Ringstrukturen an (wie in Agarose), bei denen die -OH-Gruppen wie Beine abstehen. Zucker können die gleiche “Verknüpfung” haben, aber die verknüpften Gruppen ragen auf unterschiedliche Weise heraus & wir verwenden “L” und “D”, um anzugeben, in welche Richtung die Beine im Raum zeigen. Mehr über solche Stereochemie hier: bit.ly/2Q8Dnax
Monosaccharide können ihre -OH’s benutzen, um sich miteinander zu verbinden. Wenn man 2 verbindet, erhält man ein Disaccharid. Fügt man ein paar weitere hinzu, erhält man Oligosaccharide (Oligo bedeutet wenige). Verknüpft man viele, erhält man ein Polysaccharid (poly bedeutet viele).
Apropos viele, die vielen -OHs bedeuten, dass es mehrere potenzielle Verknüpfungsstellen gibt (die wir durch die Anzahl der “Adressen” auf den Zuckerringen spezifizieren, die verbunden werden). Es kann zu “Verzweigungen” kommen, aber in Agarose hat man lineare Ketten (mit etwa 400 Untereinheiten). (Obwohl Verzweigungen mit Hilfe von “Vernetzern” eingeführt werden können, um die Agarose zu verstärken, so dass sie z. B. als Harz für die Größenausschlusschromatographie (“Gelfiltration”) verwendet werden kann, das dem hohen Druck in der FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography) standhält.
In der Agarose ist die sich wiederholende Untereinheit ein Zuckerduo (Disaccharid) aus Galaktose (D-Galaktose, um genau zu sein), das mit einem modifizierten Galaktose-Monosaccharid, 3,6-Anhydro-L-Galaktose, verbunden ist. Wir nennen dieses Duo AGAROBIOSE (wenn man eine Galaktose mit einer Glukose verbindet, erhält man Laktose, ein Disaccharid, mit dem man vielleicht besser vertraut ist).
In Galaktose haben die Ringe 6 Seiten mit 4 -OH-Schenkeln, 5 -H-Schenkeln, & 1 Methylhydroxyl (-CH₂OH)-Schenkel. Wir zeichnen die “-H”-Schenkel oft nicht, weil sie die interessanteren Schenkel verdecken, die zu Reaktionen fähig sind. In der modifizierten Galaktose von Agarose haben sich 2 der -OH-Gruppen verbunden & und einen Wasserstoff herausgeschlagen (“anhydro”), so dass der Methylhydroxyl-Arm mit einem -OH-Arm verbrückt ist und eine “Brücke” über den Ring bildet.
Ungefähr 2/3 von Agar ist Agarose, aber Agar enthält auch AGAROPECTIN. Es ist sehr ähnlich (es hat abwechselnd D & L Galaktosen), ABER viele dieser Galaktosen haben Modifikationen. Es gibt verschiedene Modifikationen, wie z. B. das Hinzufügen von Sulfat(en), Brenztraubensäure oder Methylgruppen, oder das Einfügen einer dieser verknüpften Beinversionen, wie sie in Agarose vorkommen.
Im Gegensatz zu der gleichbleibenden, sich wiederholenden Natur von AGAROSE ist nur das alternierende D- & L-Galaktose-“Skelett” in Agaropektin gleichbleibend. Seine Modifikationen sind über die gesamte Kette verstreut (zum Beispiel ist ~ jeder 10. über eine -O-Sulfat-Bindung an ein Sulfat gebunden, aber das ist nur der Durchschnitt, und es ist unwahrscheinlich, dass sie genau und gleichmäßig verteilt sind). Und während die Ketten tendenziell kürzer sind als die Agaroseketten, ist ihre Länge auch variabel, so dass Agaropektin wirklich eine ziemliche Mischung ist & man weiß nie genau, was man bekommt!
Warum das eine mehr als das andere?
DNA hat viele negativ geladene Phosphatgruppen (Phosphor umgeben von 4 Sauerstoffatomen). Dies ist die Grundlage dafür, dass sie sich durch das Gel in Richtung des positiven Endes bewegen. Das Gel muss also neutral sein.
Agar hat viele Sulfatgruppen (Schwefel, umgeben von Sauerstoff). Diese sind ebenfalls negativ geladen, so dass sie die Bewegung der DNA durch das Gel beeinträchtigen können. Es wäre also eine schlechte Matrix für die Elektrophorese.
Aber Agarose ist neutral und damit eine gute Matrix für die Elektrophorese.
Aber Agarose ist auch teurer, weil sie gereinigt werden muss. Wenn Sie sich also keine Gedanken über die physikalische Ladung machen müssen, können Sie auch etwas verwenden, das eine geringere *monetäre* Ladung hat! Da Agar weniger verarbeitet werden muss, ist es billiger & und eignet sich perfekt als Nährboden für Bakterien
In Agarplatten ist es nicht der Agar selbst, der die Nährstoffe liefert. Das ist eine der großartigen Eigenschaften von Agar – *die meisten* Bakterien können ihn nicht fressen. Stattdessen bietet der Agar nur ein “Gerüst” für die Nährstoffe, die die Bakterien benötigen. Und oft werden diese Nährstoffe durch ein flüssiges Bakteriennahrungs-“Wachstumsmedium” namens LB bereitgestellt, das, egal was in Ihren Lehrbüchern steht, (zumindest ursprünglich) für Lysogeny Broth steht. Manchmal werden die Initialen für Luria, Lennox oder Luria & Bertani für den Namen verwendet, aber in Wirklichkeit steht er für LYSOGENY BROTH, und das Rezept wurde erstmals 1951 (von Giuseppe Bertani) veröffentlicht. Er verwendete es bei der Untersuchung der Lysogenese (ein Prozess, bei dem ein bakterieninfizierendes Virus, ein so genannter Bakteriophage (“Phage”), seine eigene DNA in die DNA eines Bakteriums einfügt & und abwartet, bis die Bedingungen für den Eintritt des lytischen Phagen günstig sind, wo er sich selbst herausschneidet, Dort schneidet er sich heraus, macht viele Kopien und sprengt die Zelle auf) http://bit.ly/2HLuB1S
Der Sinn von LB besteht im Grunde darin, den Bakterien das zu geben, was sie brauchen, um zu wachsen, sich zu teilen und das zu tun, was wir wollen (z. B. Kopien der DNA zu machen, die wir in sie einfügen, und/oder Kopien von Proteinen zu machen, die die Anweisungen der DNA verwenden, die wir in sie einfügen). Und das zu einem günstigen Preis.
Anmerkung: Für die Herstellung von Proteinen und DNA in großem Maßstab züchten wir Bakterien in reiner LB-Flüssigkeit – “in Suspension” mit Schütteln -, aber wenn wir bestimmte Gruppen von Bakterien isolieren müssen, die alle von derselben “Mutterzelle” abstammen und somit genetisch identisch sind, betten wir diese LB in ein Gel ein, so dass sich verschiedene genetisch unterschiedliche “Kolonien” nicht vermischen, sondern als glitschige Punkte wachsen. Wenn Sie mehr über die verschiedenen Medien für die Suspensionen erfahren möchten, lesen Sie diesen Beitrag http://bit.ly/bacterialmedia, aber heute werde ich mich auf die in Gel eingeschlossene Form konzentrieren.
Wir geben den Bakterien keine 5-Sterne-Küche. Stattdessen wollen wir so wenig Geld wie möglich ausgeben und ihnen trotzdem die Nährstoffe geben, die sie brauchen. Zumindest müssen wir ihnen eine Energiequelle geben, etwas, das sie abbauen (katabolisieren) können, um ATP herzustellen – das können Zucker, Proteine, Fette sein. Zusätzlich zum Abbau müssen sie in der Lage sein, Dinge wie Proteine und DNA zu bilden (den anabolen Teil des Stoffwechsels durchzuführen). Dazu brauchen sie Nährstoffe, die die benötigten Elemente wie Kohlenstoff und Stickstoff liefern, die man zum Glück mit einem einfachen Rezept bekommen kann, das für viele Bakterien ausreicht.
Es gibt 3 Hauptkomponenten (obwohl 2 dieser Komponenten selbst viele Komponenten haben.
- TRYPTON -> das ist eine Mischung aus Peptiden, die durch die Verdauung eines Proteins namens Kasein mit Bauchspeicheldrüsenenzym gebildet wird -> das liefert Aminosäuren, die die Bakterien verwenden können, um neue Proteine zu bilden
- HEFEEXTRAKT -> dieses “Autolysat” der Hefe ist im Grunde nur das, was auch immer in der Hefe war (organische Verbindungen, einschließlich Vitamine, Spurenelemente, etc.) – und wenn es gut genug für die Hefe war…
- SODIUM CHLORIDE (NaCl)(Kochsalz) -> ermöglicht osmotisches Gleichgewicht, Transport, usw.
Ein paar der wichtigsten LB-Formulierungen sind die “Miller”, “Lennox”, & “Luria”-Versionen & sie unterscheiden sich in der Menge des Salzes, das sie enthalten. Miller & Bertani ertränkt die Bakterien in NaCl (10g/L), während Lennox nur 5g/L und Luria nur 0,5g/L verwendet -> solche salzarmen Rezepte sind gut, wenn man ein salzempfindliches Antibiotikum verwendet. in der Originalarbeit fügte Bertani auch Glukose hinzu, aber die meisten späteren Rezepte lassen sie weg.
Und da wir gerade von Weglassen sprechen, wir müssen sicherstellen, dass wir Bakterien, die wir nicht wollen, “weglassen”, was wir tun können, indem wir für die Bakterien, die wir wollen, “selektieren”, indem wir Selektionsmedien verwenden, die Dinge wie Antibiotika usw. enthalten, die das Wachstum von Dingen unterdrücken, die man nicht haben will. Wenn wir beispielsweise Gene in Bakterien einschleusen, tun wir dies normalerweise in Form von kreisförmigen DNA-Stücken, den so genannten Plasmiden. Wir entwerfen diese Plasmide so, dass sie auch ein Antibiotikaresistenzgen enthalten, so dass wir die Nahrung mit diesem Antibiotikum versetzen können und sie immer noch wachsen kann, aber andere Dinge nicht http://bit.ly/2tcW4ky
Es gibt auch differentielle Medien – dies ermöglicht ein “Screening” im Gegensatz zur “Selektion” – man hält Dinge nicht vom Wachstum ab, aber man verändert ihr Aussehen – zum Beispiel, Wir verwenden X-gal für das Blau-Weiß-Screening http://bit.ly/2MxNPs2
Nachdem ich ein Plasmid mit meinem Gen in Bakterien eingebracht habe und Kolonien erhalte, wähle ich ein paar dieser Kolonien aus und gebe sie in flüssiges LB (mit Antibiotikum), um über Nacht zu wachsen und viele Kopien des Plasmids zu erzeugen, dann kann ich diese Kopien aufreinigen und zur Sequenzierung schicken, um sie auf Tippfehler zu überprüfen, bevor ich in den Teil der “Expressionsvorbereitung” gehe.
Welches Medium du auch immer verwendest, es muss steril sein. Also autoklavierst du es (steckst es in eine wirklich heiße Hochdruckspülmaschine) -> stellst sicher, dass die Flaschen nicht dicht verschlossen sind, sonst explodieren sie (zum Glück habe ich diesen Fehler nicht gemacht) – und ziehst die Deckel erst wieder an, wenn die Flaschen abgekühlt sind, sonst kleben sie fest (ich *habe* diesen Fehler gemacht). Ein weiterer Fehler, den man nicht machen sollte -> fügen Sie die Antibiotika nicht vor dem Autoklavieren hinzu, sonst werden sie inaktiviert. Wir fügen sie normalerweise erst kurz vor der Verwendung hinzu.
Während meines Studiums habe ich alle meine Medien selbst hergestellt, aber hier verwenden wir so viel davon, dass wir einen “Medienmacher” als Labortechniker haben, der fantastisch ist und unsere bakteriellen Wachstumsmedien sterilisiert. Man weiß, dass etwas im Autoklaven war, wenn die Linien auf dem Autoklavenband schwarz sind – das Band ist temperaturempfindlich und ändert seine Farbe, wenn es richtig heiß wird. Ich möchte wirklich eine Reihe von Autoklavklebebändern mit Witzen und/oder Trivialitäten entwerfen – falls die ganze Sache mit dem Unterrichten nicht klappt, habe ich also eine Absicherung!
mehr zu den genannten Themen (& andere) #365DaysOfScience Alle (mit Themen aufgelistet) 👉 http://bit.ly/2OllAB0
