Formaldehydové fixační prostředky

Informace o 37% formaldehydu

Neexistuje žádný definitivní věk, po kterém by 37% formaldehyd přestal být použitelný jako zásobní roztok. Chemie formaldehydu je středně složitá, ale po diskusích s dalšími mikroskopisty, výrobci a prostudování příslušných textů platí následující poznámky.

• Formaldehyd by měl být skladován při pokojové teplotě (nízké teploty podporují tvorbu trioxymethylenu s výslednou bílou sraženinou)
• Formaldehyd by měl být skladován pevně uzavřený, protože vystavení vzduchu podporuje oxidaci formaldehydu na kyselinu mravenčí (37% formaldehyd se obvykle dodává s 10-15% metanolem, aby se tato změna potlačila).

Naše doporučení týkající se 37% zásobních roztoků: Pokud je roztok 37% formaldehydu čirý, bezbarvý, bez sraženin a byl skladován při pokojové teplotě v těsně uzavřené lahvi, která nebyla vystavena slunečnímu záření, měl by být v pořádku, přesto však nedoporučujeme používat zásobní lahve starší než 1 rok. Lahve s 37% formaldehydem, které jsou již otevřené, by se neměly používat déle než šest měsíců. V důsledku toho doporučujeme, aby laboratoře nakupovaly formaldehyd častěji a v menším množství, než tomu možná bylo v minulosti.

Použití 37% formaldehydu se nedoporučuje pro fixační prostředky pro elektronovou mikroskopii. Mnohem lepší volbou je buď vyšší třída formaldehydu bez metanolu, nebo čerstvý roztok vyrobený z paraformaldehydu (viz další poznámky níže).

Informace o 10% formalinu

Fixační prostředek 10% pufrovaný formalin se běžně používá k uchovávání tkání pro rutinní histologii v mnoha laboratořích. Formaldehyd má v této koncentraci tkáňového fixativa větší šanci na oxidaci a nakonec začne pH roztoku klesat, a to i přes přítomnost pufru. Doporučujeme, aby se 10% pufrované roztoky formalinu používaly nejdéle 3 měsíce po jejich původním namíchání. Roztok by měl být čirý, bezbarvý, bez sraženin a pH by nemělo být nižší než 6,5.

Dalším problémem 10% pufrovaného formalínu je pomalu se zvyšující koncentrace metanolu (nežádoucí vedlejší produkt stárnutí formaldehydu). Metanol podporuje shlukování proteinů namísto zesíťování proteinů, které provádí formaldehyd. Fixační prostředek bez metanolu zajistí nejlepší konzervaci, zejména pokud plánujete tkáň později použít k barvení protilátkami.

Nejběžnějším způsobem, jak se vyhnout metanolu v roztoku formaldehydu, je připravit roztok čerstvý z krystalického paraformaldehydu. Manipulace s paraformaldehydem může být poměrně nebezpečná a často je obtížné ho dostat do roztoku. Pokud vaše laboratoř není pravidelným uživatelem formaldehydových fixativ, existuje několik jednodušších možností, které doporučujeme.

Jednou z možností je zakoupit formaldehyd (aq) bez metanolu v uzavřených ampulích. Stačí přidat PBS pro dosažení správné koncentrace formaldehydu a ihned použít. Deset 10 ml ampulí 16% formaldehydu bez metanolu stojí přibližně 27 USD.

Druhou možností je zakoupit 10% neutrální pufrovaný formalín (4% formaldehyd) v obchodě s vědeckými potřebami, používat jej 3-6 měsíců a poté jej zlikvidovat (jako nebezpečný materiál). V tomto roztoku bude určité množství metanolu (obvykle 1-2 %), ale při použití brzy po zakoupení by to pro většinu uživatelů nemělo být významné. Pufrovaný roztok pomáhá zpomalit proces okyselování. Litrová láhev stojí přibližně 20-25 USD. Fixační roztok skladujte při pokojové teplotě. Místní čtenáři této stránky by se v případě potíží s nalezením dodavatele měli obrátit na laboratoř histologických služeb CMM (626-4415). (Upozorňujeme, že různí dodavatelé používají různé pufrovací roztoky. Pro konzistentní imunohistochemii a/nebo imunofluorescenci by se uživatelé měli držet jednoho dodavatele).

Některé laboratoře se ptaly na použití nepufrovaného 10% formalínu. Pokud pro tuto volbu není specifický důvod, nedoporučujeme ji, protože toto fixační činidlo se rychle stává kyselým. Skladování tkání v tomto fixativu po dobu delší než několik hodin by se mělo důrazně nedoporučovat.

Doporučení pro optimální fixaci vzorků

Tkáňové vzorky by měly být umístěny do fixativu co nejrychleji po jejich vyjmutí ze zvířete, fixativum by mělo být alespoň 20krát větší než objem tkáně a fixativum by mělo být vyměněno po první hodině fixace.

Tkáň by měla být nařezána tak, aby nejtenčí rozměr nebyl větší než 4-5 mm na tloušťku (průnik formalínu je pomalý, přibližně 0,5 mm/hod). To je přibližně tloušťka dvou amerických čtvrtek. Pokud má tkáň nebo orgán silné pouzdro (např. ledvina), měli by si uživatelé uvědomit, že průnik fixačního prostředku pouzdrem nebude tak rychlý. Příliš silné vzorky mohou skončit příliš fixované na vnější straně a špatně fixované na vnitřní straně, což způsobuje problémy s interpretací kvůli artefaktům při barvení.

Počáteční fixace by měla probíhat při pokojové teplotě, protože průnik formalínu souvisí s teplotou roztoku. Před použitím by se měl formalín jemně protřepat, aby se zabránilo vzniku koncentračního gradientu v lahvičce.

Čas fixace je do jisté míry závislý na tloušťce tkáně.

• Monovrstvy kultivovaných buněk není třeba fixovat dlouho, obvykle stačí 15-30 min. Kultivované buňky by měly jít z fixace do jakéhokoli protokolu, který laboratoř uživatele používá pro imunohistochemii/imunofluorescenci.
• Tkáně a orgány by měly být fixovány (v závislosti na jejich velikosti) po dobu 2 hodin až maximálně 24 hodin. Poté lze tkáně krátkodobě (nejlépe ne déle než 3 dny) uchovávat v 70% ethanolu (aq). Delší skladování v obou roztocích může způsobit přílišnou tvrdost tkáně a vede k obtížím při řezání parafinových bloků.

Přesné dodržování standardizovaného fixačního protokolu povede k nejkonzistentnějším výsledkům.

Formalin vs. formaldehyd

Občas jsme se setkali s nejasnostmi ohledně rozdílu mezi formaldehydem a formalínem. Je to pochopitelný problém, protože tyto pojmy se někdy používají zaměnitelně. Používání obou slov tímto způsobem je nesprávné. Koncentrace chemických fixativ, které oba názvy představují, jsou zcela odlišné.

Fixativum označené jako 10% pufrovaný formalín je ve skutečnosti pouze 4% roztok formaldehydu. Je to proto, že 10% pufrovaný formalín je příkladem starého histologického žargonu, který popisuje 10% roztok vyrobený ze zásobní láhve 37-40% formaldehydu (nebo přesněji: 3,7-4% roztok formaldehydu).

Bezpečnost formaldehydu

Úřad Spojených států pro bezpečnost a ochranu zdraví při práci (OSHA) má velké obavy z formaldehydu. Pokud nemáte ve své laboratoři aktuální bezpečnostní list materiálu (MSDS) pro formaldehyd, můžete jej najít v archivu SIRI MSDS.

Prosím, uvědomte si nebezpečí spojená s formaldehydem. Následující věta pochází z bezpečnostního listu pro 10% pufrovaný formalín:

“NEBEZPEČÍ! PŘI POŽITÍ MŮŽE BÝT SMRTELNÝ. ŠKODLIVÝ PŘI VDECHNUTÍ NEBO VSTŘEBÁNÍ KŮŽÍ. ZPŮSOBUJE PODRÁŽDĚNÍ KŮŽE, OČÍ A DÝCHACÍCH CEST. SILNÝ SENZIBILIZÁTOR. MŮŽE ZPŮSOBIT OSLEPNUTÍ. HOŘLAVÁ KAPALINA A PÁRY. PODEZŘENÍ NA NEBEZPEČÍ RAKOVINY. OBSAHUJE FORMALDEHYD, KTERÝ MŮŽE ZPŮSOBIT RAKOVINU. Riziko vzniku rakoviny závisí na délce trvání a úrovni expozice.”

(pro místní čtenáře) Oddělení řízení rizik Arizonské univerzity nabízí samostudijní program s názvem “Školení o nebezpečnosti formaldehydu”. Tato příručka vás seznámí se všemi důležitými aspekty normy OSHA pro formaldehyd z roku 1992. Podle oddělení řízení rizik je “každoroční školení vyžadováno u osob, které používají roztoky formaldehydu vyšší než 0,1 % nebo materiály schopné uvolňovat více než 0,1 ppm formaldehydu”. To by se týkalo většiny z nás, kteří používáme formaldehyd jako fixační činidlo pro histologii nebo elektronovou mikroskopii.

Chcete-li získat kopii letáku “Hazard Communication Training for Formaldehyde”, obraťte se přímo na oddělení řízení rizik a bezpečnosti (621-1570, pouze pro fakulty, zaměstnance a studenty Arizonské univerzity).

▲ na začátek stránky

.