Formaldehydfikseringsmidler

Information om 37% formaldehyd

Der er ingen endelig alder, hvorefter 37% formaldehyd ikke længere er brugbar som opløsning. Formaldehydkemi er moderat kompleks, men efter drøftelser med andre mikroskopikere, producenter og gennemgang af relevante tekster er følgende bemærkninger gældende.

• Formaldehyd bør opbevares ved stuetemperatur (kolde temperaturer fremmer dannelsen af trioxymethylen med en resulterende hvid udfældning)
• Formaldehyd bør opbevares tæt forseglet, da udsættelse for luft fremmer oxidation af formaldehyd til myresyre (37% formaldehyd sendes normalt med 10-15% methanol for at hæmme denne ændring).

Vores anbefalinger vedrørende 37% lageropløsninger: Hvis en opløsning af 37% formaldehyd er klar, farveløs og uden udfældning og er blevet opbevaret ved stuetemperatur i en tæt lukket flaske, der ikke har været udsat for sollys, bør den være god, men vi anbefaler dog stadig ikke at bruge en lagerflaske, der er ældre end 1 år. Flasker med 37% formaldehyd, der allerede er åbnet, bør ikke bruges mere end seks måneder. Derfor anbefaler vi, at laboratorierne køber deres formaldehyd hyppigere og i mindre mængder, end de måske tidligere har gjort.

Brug af 37 % formaldehyd anbefales ikke til elektronmikroskopi-fikseringsmidler. Enten en højere kvalitet, methanolfri formaldehyd eller en frisk opløsning fremstillet af paraformaldehyd er et langt bedre valg (se yderligere kommentarer nedenfor).

Information om 10% formalin

Fixeringsmidlet 10% buffered formalin anvendes almindeligvis til konservering af væv til rutinemæssig histologi i mange laboratorier. Formaldehydet har større chance for oxidation i denne koncentration af vævsfikseringsmiddel, og til sidst vil opløsningen begynde at falde i pH-værdi på trods af bufferen. Vi anbefaler, at 10 % bufferformalinopløsninger ikke anvendes længere end 3 måneder efter, at de oprindeligt blev blandet. Opløsningen bør være klar og farveløs uden udfældning, og pH bør ikke være under 6,5.

Det andet problem med 10 % bufferet formalin er den langsomt stigende koncentration af methanol (et uønsket biprodukt af aldrende formaldehyd). Methanol fremmer sammenklumpning af proteiner i stedet for den tværbinding af proteiner, som formaldehydet udfører. Et methanolfrit fiksationsmiddel vil give den bedste konservering, især hvis man planlægger at bruge vævet til antistoffarvning på et senere tidspunkt.

Den mest almindelige måde at undgå methanol i en formaldehydopløsning på er at fremstille opløsningen frisk af krystallinsk paraformaldehyd. Paraformaldehyd kan være ret farligt at håndtere, og det er ofte svært at få det til at gå i opløsning. Hvis dit laboratorium ikke er en regelmæssig bruger af formaldehydfikseringsmidler, er der et par lettere muligheder, som vi anbefaler.

En mulighed er at købe methanolfri formaldehyd (aq) i forseglede ampuller. Du skal blot tilsætte PBS for at opnå den korrekte formaldehydkoncentration og bruge den straks. Ti 10 ml ampuller med 16 % methanolfri formaldehyd på 10 ml koster ca. 27 $.

Den anden mulighed er at købe 10 % neutralt buffered Formalin (4 % formaldehyd) fra et videnskabeligt forsyningshus, bruge det i 3-6 måneder og derefter kassere det (som farligt materiale). Der vil være noget methanol i denne opløsning (typisk 1-2%), men hvis den bruges kort tid efter købet, bør det ikke være væsentligt for de fleste brugere. Den bufferede opløsning er med til at forsinke forsuringsprocessen. En flaske på en liter koster ca. 20-25 dollars. Opbevar fixeringsmidlet ved stuetemperatur. Lokale læsere af denne side bør kontakte CMM Histology Service Lab (626-4415), hvis du har problemer med at finde en leverandør. (Bemærk venligst, at forskellige leverandører anvender forskellige bufferopløsninger. For at opnå ensartet immunohistokemi og/eller immunofluorescens bør brugerne holde sig til én leverandør).

Nogle laboratorier har spurgt om brug af ubufferet 10 % formalin. Medmindre der er en særlig grund til dette valg, anbefaler vi det ikke, da dette fixeringsmiddel hurtigt bliver surt. Opbevaring af væv i dette fiksationsmiddel ud over flere timer bør stærkt frarådes.

Anbefalinger for optimal fiksering af prøver

Vævsprøver bør anbringes i fiksationsmiddel så hurtigt som rimeligt, efter at de er blevet fjernet fra et dyr, fiksationsmidlet bør være mindst 20 gange vævets volumen, og fiksationsmidlet bør skiftes efter den første times fiksering.

Vævet bør skæres således, at den tyndeste dimension ikke er mere end 4-5 mm i tykkelse (formalinindtrængning er langsom, ca. 0,5 mm/time). Dette svarer ca. til tykkelsen af to amerikanske kvartaler. Hvis vævet eller organet har en tyk kapsel (f.eks. en nyre), skal brugerne være opmærksomme på, at indtrængning af fikseringsmiddel ikke vil ske så hurtigt gennem kapslen. For tykke prøver kan ende med at blive overfikseret på ydersiden og dårligt fikseret på indersiden, hvilket giver fortolkningsproblemer på grund af farvningsartefakter.

Den indledende fiksering bør foregå ved stuetemperatur, da formalinets penetration er relateret til opløsningens temperatur. Formalin bør rystes forsigtigt før brug for at undgå en koncentrationsgradient i flasken.

Fixeringstiden afhænger i nogen grad af vævets tykkelse.

• Monolag af dyrkede celler behøver ikke at blive fikseret længe, typisk er 15-30 min. tilstrækkeligt. Kulturceller bør gå fra fiksering til den protokol, som brugerens laboratorium anvender til immunohistokemi/immunofluorescens.
• Væv og organer bør fikseres (afhængigt af deres størrelse) i 2 timer til højst 24 timer. Herefter kan vævene opbevares i korte perioder (helst ikke mere end 3 dage) i 70 % ethanol (aq). Længere opbevaring i begge opløsninger kan medføre, at vævet bliver for hårdt og fører til vanskeligheder med at skære paraffinblokkene ud.

Men nøje overholdelse af en standardiseret fikseringsprotokol vil føre til de mest konsistente resultater.

Formalin vs. formaldehyd

Vi har lejlighedsvis oplevet en vis forvirring omkring forskellen mellem formaldehyd og formalin. Dette er et forståeligt problem, da begreberne nogle gange bruges i flæng. Det er forkert at bruge de to ord på denne måde. De koncentrationer af kemisk fiksationsmiddel, som de to navne repræsenterer, er ganske forskellige.

Et fiksationsmiddel, der er mærket som 10% bufferet formalin, er faktisk kun en 4% opløsning af formaldehyd. Det skyldes, at 10 % bufferet formalin er et eksempel på gammeldags histologjargon, der beskriver en 10 % opløsning fremstillet af en lagerflaske med 37-40 % formaldehyd (eller mere præcist: en 3,7-4 % opløsning af formaldehyd).

Formaldehydsikkerhed

Den amerikanske arbejdstilsynsmyndighed OSHA (Occupational Safety and Health Administration) er meget bekymret for formaldehyd. Hvis du ikke har et aktuelt sikkerhedsdatablad (MSDS) i dit laboratorium for formaldehyd, kan du finde et på SIRI MSDS Archive.

Vær opmærksom på de farer, der er forbundet med formaldehyd. Følgende udsagn stammer fra et sikkerhedsdatablad for 10% bufferet formalin:

“FARE! KAN VÆRE LIVSFARLIGT, HVIS DET SLUGES. SKADELIGT, HVIS DET INDÅNDES ELLER ABSORBERES GENNEM HUDEN. FORÅRSAGER IRRITATION AF HUD, ØJNE OG ÅNDEDRÆTSVEJE. STÆRKT SENSIBILISERENDE. KAN FORÅRSAGE BLINDHED. BRÆNDBAR VÆSKE OG DAMP. FORMODET KRÆFTRISIKO. INDEHOLDER FORMALDEHYD, SOM KAN FORÅRSAGE KRÆFT. Risiko for kræft afhænger af varighed og niveau af eksponering.”

(for lokale læsere) University of Arizona Department of Risk Management har et selvstudieprogram kaldet “Hazard Communication Training for Formaldehyde”. Denne vejledning vil introducere dig til alle de relevante aspekter af OSHA-standarden for formaldehyd fra 1992. Ifølge Risk Management er “årlig uddannelse påkrævet for personer, der anvender formaldehydopløsninger på mere end 0,1 % eller materialer, der kan frigive mere end 0,1 ppm formaldehyd”. Dette ville omfatte de fleste af os, der bruger formaldehyd til histologiske eller elektronmikroskopiske fixeringsmidler.

For at få et eksemplar af håndbogen “Hazard Communication Training for Formaldehyde” skal du kontakte Dept. of Risk Management and Safety direkte (621-1570, University of Arizona faculty, staff and students only).

▲ top of page