Formaldehydifiksatiivit

Tietoa 37-prosenttisesta formaldehydistä

Ei ole määriteltyä ikää, jonka jälkeen 37-prosenttinen formaldehydi ei ole enää käyttökelpoinen kantaliuoksena. Formaldehydin kemia on kohtalaisen monimutkaista, mutta keskusteltuamme muiden mikroskooppien ja valmistajien kanssa sekä käytyämme läpi asiaankuuluvia tekstejä, seuraavat havainnot ovat sovellettavissa.

• Formaldehydi tulisi säilyttää huoneenlämmössä (kylmät lämpötilat edistävät trioksimetyleenin muodostumista ja siitä aiheutuvaa valkoista sakkaa)
• Formaldehydi tulisi säilyttää tiiviisti suljettuna, koska altistuminen ilmalle edistää formaldehydin hapettumista muurahaishapoksi (37-prosenttinen formaldehydi toimitetaan yleensä 10-15-prosenttisen metanolin kanssa tämän muutoksen estämiseksi).

Suosituksemme 37-prosenttisista varastoliuoksista: Jos 37-prosenttisen formaldehydin liuos on kirkas, väritön eikä siinä ole saostumia ja se on säilytetty huoneenlämmössä tiiviisti suljetussa pullossa, joka ei ole altistunut auringonvalolle, sen pitäisi olla hyvä, mutta emme silti suosittele yli 1 vuotta vanhan varastopullon käyttöä. Jo avattuja 37-prosenttista formaldehydiä sisältäviä pulloja ei tulisi käyttää yli kuuden kuukauden ajan. Näin ollen suosittelemme, että laboratoriot hankkivat formaldehydiä useammin ja pienemmissä erissä kuin ehkä aiemmin.

37-prosenttisen formaldehydin käyttöä ei suositella elektronimikroskopian fiksatiiveihin. Joko korkeamman laatuluokan metanoliton formaldehydi tai paraformaldehydistä valmistettu tuore liuos on paljon parempi valinta (ks. tarkemmat kommentit jäljempänä).

Tietoa 10 %:n formaliinista

10 %:n puskuroidusta formaliinista valmistettua fiksatiivia käytetään yleisesti kudosten säilömiseen rutiininomaista histologiaa varten monissa laboratorioissa. Formaldehydillä on suurempi mahdollisuus hapettua tässä kudosten fiksaatiokonsentraatiossa ja lopulta liuoksen pH alkaa laskea puskurista huolimatta. Suosittelemme, että 10-prosenttista puskuroitua formaliiniliuosta käytetään enintään 3 kuukautta sen jälkeen, kun se on alun perin sekoitettu. Liuoksen tulisi olla kirkas, väritön, saostumatonta, eikä pH:n tulisi olla alle 6,5.

Toinen 10 %:n puskuroidun formaliinin ongelma on hitaasti kasvava metanolipitoisuus (formaldehydin vanhenemisen ei-toivottu sivutuote). Metanoli edistää proteiinien paakkuuntumista eikä proteiinien ristisilloittumista, jonka formaldehydi suorittaa. Metanoliton fiksatiivi antaa parhaan säilyvyyden, erityisesti jos kudosta aiotaan käyttää myöhemmin vasta-ainevärjäykseen.

Yleisin tapa välttää metanolia formaldehydiliuoksessa on valmistaa liuos tuoreena kiteisestä paraformaldehydistä. Paraformaldehydi voi olla varsin vaarallista käsitellä ja sitä on usein vaikea saada menemään liuokseen. Jos laboratoriossasi ei käytetä säännöllisesti formaldehydifiksatiiveja, on pari helpompaa vaihtoehtoa, joita suosittelemme.

Yksi vaihtoehdoista on ostaa metanolitonta formaldehydiä (aq) suljetuissa ampulleissa. Lisää vain PBS:ää oikean formaldehydipitoisuuden saavuttamiseksi ja käytä heti. Kymmenen 10 ml:n ampullia 16-prosenttista metanolivapaata formaldehydiä maksaa noin 27 dollaria.

Toinen vaihtoehto on ostaa 10-prosenttista neutraalipuskuroitua formaliinia (4-prosenttista formaldehydiä) tieteellisestä tarvikeliikkeestä, käyttää sitä 3-6 kuukautta ja sitten hävittää se (vaarallisena aineena). Tässä liuoksessa on jonkin verran metanolia (tyypillisesti 1-2 %), mutta jos sitä käytetään pian oston jälkeen, sen ei pitäisi olla merkittävää useimmille käyttäjille. Puskuroitu liuos auttaa hidastamaan happamoitumisprosessia. Yhden litran pullo maksaa noin 20-25 dollaria. Säilytä kiinnitysaine huoneenlämmössä. Tämän sivun paikallisten lukijoiden kannattaa ottaa yhteyttä CMM:n histologian palvelulaboratorioon (626-4415), jos toimittajaa on vaikea löytää. (Huomaa, että eri toimittajat käyttävät erilaisia puskuriliuoksia. Yhdenmukaisen immunohistokemian ja/tai immunofluoresenssin aikaansaamiseksi käyttäjien tulisi pitäytyä yhdessä toimittajassa).

Jotkut laboratoriot ovat kysyneet puskuroimattoman 10 %:n formaliinin käytöstä. Ellei tähän valintaan ole erityistä syytä, emme suosittele sitä, koska tämä fiksatiivi muuttuu nopeasti happamaksi. Kudosten säilyttämistä tässä fiksatiivissa useiden tuntien ajan on ehdottomasti vältettävä.

Suositukset näytteiden optimaaliseen fiksaatioon

Kudosnäytteet on asetettava fiksatiiviin niin nopeasti kuin on kohtuullista sen jälkeen, kun ne on poistettu eläimestä, fiksatiivin määrän on oltava vähintään 20-kertainen kudoksen tilavuuteen nähden, ja fiksatiivi on vaihdettava ensimmäisen fiksaatiotunnin jälkeen.

Kudos on leikattava siten, että sen ohuin ulottuvuus on enintään 4-5 mm paksu (formaliinin tunkeutuminen on hidasta, noin 0,5 mm/h). Tämä on suunnilleen kahden Yhdysvaltain neljänneksen paksuus. Jos kudoksessa tai elimessä on paksu kapseli (esim. munuainen), käyttäjien on huomioitava, että fiksatiivin tunkeutuminen kapselin läpi ei ole yhtä nopeaa. Liian paksut näytteet voivat päätyä ulkopuolelta ylifiksoituneiksi ja sisäpuolelta huonosti fiksoituneiksi, mikä aiheuttaa tulkintaongelmia värjäytymisartefaktien vuoksi.

Alustavan fiksaation tulisi tapahtua huoneenlämmössä, koska formaliinin tunkeutuminen on riippuvainen liuoksen lämpötilasta. Formaliinia on ravistettava kevyesti ennen käyttöä, jotta pullossa ei muodostuisi konsentraatiogradienttia.

Fiksaatioaika riippuu jonkin verran kudoksen paksuudesta.

• Viljeltyjen solujen monolayerejä ei tarvitse fiksoida pitkään, tyypillisesti 15-30 min on riittävä aika. Viljeltyjen solujen tulisi mennä fiksaatiosta siihen protokollaan, jota käyttäjän laboratorio käyttää immunohistokemiaan/immunofluoresenssiin.
• Kudoksia ja elimiä tulisi fiksoida (niiden koosta riippuen) 2 tunnista enintään 24 tuntiin. Tämän jälkeen kudoksia voidaan säilyttää lyhyitä aikoja (mieluiten enintään 3 päivää) 70-prosenttisessa etanolissa (aq). Pidempi säilytys kummassakin liuoksessa voi aiheuttaa kudoksen liiallisen kovettumisen ja johtaa vaikeuksiin leikata parafiinilohkoja.

Standardoitua fiksaatioprotokollaa noudattamalla saadaan mahdollisimman yhdenmukaiset tulokset.

Formaliini vs. formaldehydi

Olemme toisinaan törmänneet epäselvyyksiin formaldehydin ja formaliinin erosta. Tämä on ymmärrettävä ongelma, koska termejä käytetään joskus vaihdellen. On väärin käyttää näitä kahta sanaa näin. Kemiallisen fiksatiivin pitoisuudet, joita nämä kaksi nimeä edustavat, ovat aivan erilaisia.

Fiksatiivi, joka on merkitty 10-prosenttiseksi puskuroiduksi formaliiniksi, on itse asiassa vain 4-prosenttinen formaldehydiliuos. Tämä johtuu siitä, että 10 %:n puskuroitu formaliini on esimerkki vanhan ajan histologijargonista, jolla kuvataan 10 %:n liuosta, joka on valmistettu 37-40 %:n formaldehydiä sisältävästä varastopullosta (tai tarkemmin sanottuna: 3,7-4 %:n formaldehydiliuoksesta).

Formaldehydin turvallisuus

Yhdysvaltojen työterveys- ja työturvallisuusvirasto (OSHA, Occupational Safety and Health Administration)

On hyvin huolissaan formaldehydin käytöstä. Jos laboratoriossasi ei ole voimassa olevaa käyttöturvallisuustiedotetta (MSDS) formaldehydistä, voit etsiä sellaisen SIRI:n käyttöturvallisuustiedotearkistosta.

Ole tietoinen formaldehydin aiheuttamista vaaroista. Seuraava lausunto on peräisin 10 % puskuroidun formaliinin käyttöturvallisuustiedotteesta:

“VAARA! VOI OLLA HENGENVAARALLINEN NIELTYNÄ. HAITALLISTA HENGITETTYNÄ TAI IHON LÄPI IMEYTYNEENÄ. AIHEUTTAA IHON, SILMIEN JA HENGITYSTEIDEN ÄRSYTYSTÄ. VOIMAKAS HERKISTÄVÄ AINE. VOI AIHEUTTAA SOKEUTTA. PALAVA NESTE JA HÖYRY. EPÄILLÄÄN SYÖPÄVAARAA. SISÄLTÄÄ FORMALDEHYDIÄ, JOKA VOI AIHEUTTAA SYÖPÄÄ. Syöpäriski riippuu altistumisen kestosta ja tasosta.”

(paikallisille lukijoille) Arizonan yliopiston riskienhallintaosastolla on itseopiskeluohjelma “Hazard Communication Training for Formaldehyde”. Tämä opas perehdyttää sinut kaikkiin vuoden 1992 OSHA:n formaldehydistandardin olennaisiin näkökohtiin. Riskienhallinnan mukaan “vuosittainen koulutus vaaditaan henkilöiltä, jotka käyttävät yli 0,1-prosenttisia formaldehydiliuoksia tai materiaaleja, joista voi vapautua yli 0,1 ppm formaldehydiä”. Tämä sisältäisi useimmat meistä, jotka käyttävät formaldehydiä histologian tai elektronimikroskopian fiksaattoreina.

Voidaksesi saada kopion “Hazard Communication Training for Formaldehyde” -esitteestä, ota yhteyttä suoraan riskienhallinta- ja turvallisuusosastoon (621-1570, vain Arizonan yliopiston tiedekunta, henkilökunta ja opiskelijat).

▲ sivun alkuun