Mikroskopi er vigtigt i mange aspekter af mykologien. Det har 3 hovedformål:

1. Detektion af svampe direkte i kliniske prøver – de særlige udseende kan være meget karakteristiske for visse infektioner, f.eks. zygomycet-infektion eller India Ink i cerebrospinalvæske. Direkte mikroskopi er, hvis den er positiv, hurtigere end dyrkning.
2. Bekræftelse af, at en dyrkning af en luftbåren svamp, f.eks. Aspergillus, er årsagen til infektionen og sandsynligvis ikke er et forurenende stof.
3. Identificering af svampe på grundlag af morfologiske udseende.

Afsnittet nedenfor er ret teknisk og specifikt og er skrevet til den laboratoriemedarbejder, der ønsker at forbedre påvisningsgraden og rapporteringsfærdighederne.

Denne tabel viser de vigtigste prøvetyper og fund, der anvendes til direkte mikroskopi.

Probe	Svampe påvises og udseende
CSF	Ejre af Cryptococcus	Indiskpræparat.
Hår, negle og hudskrab	Hyfer af dermatofyter eller andre filamentøse svampe Yeaster af Candida	Differente svampe kan ikke skelnes. Kulturer ofte negative, så mikroskopi kun bevis for infektion.
Slimhinde fra paranasale bihuler	Hyphaer påviselige i slimhinden er diagnostisk for eosinofil svampes rhinosinusitis	Slimhinden bør fikseres og farves som ved histopatologiske snit. Hyphaer kan være undvigende.
Ørester/skrabning	Hyphaer, sædvanligvis med sporulerende hoveder typisk for Aspergillus niger.	Fiktivt blandet med Candida og gærceller.
Korneal skrabning for keratitis	Der kan ses gærsvampe eller filamentøse svampe	Hjælpeligt tidligt tegn på mykotisk keratitis, skelner ikke mellem forårsagende arter
Tvævsaspiration eller biopsi	Hyphaer af filamentøse svampe Yeaster af Candida eller andre gærsvampe. Sfærer af C. immitis	En del svampe meget karakteristiske, herunder små gærsvampe uden hyfer, der tyder på C. glabrata, eller ikke-septate hyfer af en Zygomycete.
Atmningsvæsker	Hyfer uden betydning Hyphaer (uden gær), der er forenelige med sygdom Pneumocystis jirovecii	Hyphaer normalt septate og typiske for Aspergillus, men hvis de ikke er septate, skal man overveje zygomycosis eller mucormycosis. Imuunofluorescens overlegen for P. jirovecii
Blodfilm eller knoglemarv	Intracellulære gærsvampe typisk for Histoplasma eller sjældent Penicillium	Et træk ved dissemineret histoplasmose og findes i 40%.
Peritonealvæske	Gæster eller sjældent hyphaer	Hjælpsomt ved bekræftelse af Candida peritonitis
Vaginal svaber/prøve	Candida albicans (gær og hyfer) eller Candida glabrata	Nøgle diagnostisk test
Mycetoma korn	Kan vise hyfer med karakteristika	Ofte ikke endegyldigt med hensyn til art

Skabende metode

Det ældste specifikke præparat til mikroskopi er et koncentreret (10-20%) kaliumhydroxidopløsning, som blødgør keratin og muliggør direkte visualisering af svampe og en vis morfologisk vurdering. Gramfarvninger er mindre følsomme. Papanicolau-farver kan være nyttige. Cytologiske objektglas kan farves med sliver- eller Gomori Methenamine Silver (GMS)-farver. Immunofluorescensmikroskopi er den bedste metode til påvisning af Pneumocystis. Fluorescerende lysere (Calcofluor white, Blankophor eller Tinopal UNPA-GX), som binder sig til chitin i svampens cellevæg, er et hurtigt middel til at scanne prøverne for svampehyfer og forbedrer morfologibedømmelsen.

Mikroskopiens diagnostiske rolle i forbindelse med specifikke sygdomme

CSF og meningitis

Indkapslede Cryptococcus-celler kan ofte påvises i prøver af CSF eller andre værtsvæsker eller sekreter, der er monteret i tusch. Ca. 50 % af HIV-negative og mere end 80 % af HIV-positive patienter har en positiv tuschundersøgelse af CSF. Især intakte lymfocytter kan dog forveksles med organismen. Hos personer med AIDS er der normalt mange Cryptococcus-celler i CSF, selv om kapslerne kan være små, hvilket gør det vanskeligt at genkende dem. Vedvarende positive CSF-fund hos patienter under behandling bør kun betragtes som tegn på fiasko eller tilbagefald, hvis de bekræftes af en forværring af patientens kliniske tilstand eller af positive kulturer.

Indisk blækpræparat af CSF, der viser flere gærsvampe med store kapsler og smalle knopper til mindre datterceller, typisk for C. neoformans

Transmissionselektronmikroskopisk billede af en C. neoformans-celle set i CSF hos en AIDS-patient med bemærkelsesværdigt lidt kapsel til stede. Disse celler kan forveksles med lymfocytter.

En filamentøs svamp i CSF fra en patient med meningitis, som efterfølgende dyrkede Candida albicans i kultur.

Hår

Prøver fra hovedbunden bør omfatte hårrødder, indholdet af tilstoppede follikler og hudskæl. Bortset fra favus indeholder den distale del af inficeret hår sjældent svamp. Af denne grund er afskårne hår uden rødder uegnede til mykologiske undersøgelser. En metode, der er nyttig til indsamling af materiale fra hovedbunden, er hårbørsteprøver.

Direkte mikroskopisk undersøgelse af inficeret materiale bør afsløre dermatofytens arthrokonidier, der er placeret uden for (ectothrix) eller inden for (endothrix) det angrebne hår. Arthrokonidierne kan være enten små (2-4 um i diameter) eller store (op til 10 um i diameter) i størrelse. Hudskæl vil indeholde hyfer og arthroconidier. Ved T. schoenleinii-infektion (favus) ses løse kæder af arthroconidier og luftrum i de angrebne hårstrå. Scutulum (skorpe) består af mycelium, neutrofiler og epidermalceller.

Hudskrabning viser filamentøse hyfer med blankophor.

Negle

Kvaliteten af det udtagne prøveemne er en vigtig faktor for, om mikroskopi og dyrkning lykkes eller ej. Det bør være smertefrit at få taget en prøve bortset fra lejlighedsvis let ubehag, når der tages subunguale prøver. Figuren nedenfor viser de steder, hvor negleprøver bør udtages

Skrabninger taget med en stump skalpel eller udklip bør transporteres i en foldet firkant af papir, fortrinsvis fastgjort med en papirclips, men der findes også mykologiske pakninger i handelen. I laboratoriet tilsættes 20-30% kaliumhydroxidopløsning til en del af prøven for at macerere neglekeratinet, således at prøven kan undersøges for svampeelementer ved direkte mikroskopi. Alternativt undersøges en del af hver prøve i en negleopløsningsopløsning, der indeholder et fluorochrom . Et eksempel på en reaktiv opløsning er denne. Den fremstilles ved at opløse 1 g Na2S i 7,5 ml destilleret vand og derefter tilsætte 2,5 ml ethanol. Herefter tilsættes 10 ml Blankophor eller 20 ml 1% vandig opløsning af Tinopal UNPA-GX (Fluorescerende lysgiver 28, F3543; Sigma) til denne blanding.

Slimhinde fra bihulehulerne

Et diagnostisk træk ved allergisk svampet rhinosinusitis (AFRS) er tilstedeværelsen af eosinofilt mucin indeholdende hyfer, der er opsamlet fra patientens næse eller bihulehulerne uden tegn på vævsinvasion af svamp. Hyphaer kan være sparsomme i bihuleindholdet og tager lang tid at visualisere med de i øjeblikket anvendte farvestoffer. Uden dette positive træk stilles der normalt andre diagnoser, herunder allergisk rhinosinusitis (ARS) eller eosinofil mucinrhinosinusitis (EMRS). Anvendelsen af langt mere følsomme diagnostiske teknikker, som f.eks. chitinfarvning eller specifikke anti-Alternaria-immunofluorescensfarver, kan dog forbedre følsomheden. Understøttende diagnostiske træk omfatter tilstedeværelsen af Charcot-Leyden-krystaller, knogleerosion og heterogen uklarhed med sinusudvidelse på CT-scanning.

Hørekanal og otitis externa

Debris og sekret bør udtages fra øregangen. Direkte mikroskopisk undersøgelse vil afsløre forgrenede hyphaer, spirende gærceller eller begge dele. I tilfælde af Aspergillus-infektion kan man undertiden se de typiske sporinghoveder.

Corneal skrabning for keratitis

Svampkeratitis er en medicinsk nødsituation og skal erkendes og behandles omgående. Til mikrobiologisk diagnose er den bedste prøve materiale fra den angrebne del af cornea; materialet kan indsamles i form af skrab fra et ulcereret område eller biopsi, når cornea-epithelet er intakt og infektionen er begrænset til cornea-stromaet. Hornhindeudskrabninger udtages ved hjælp af et instrument som f.eks. en platinspatel, Beaver-kniv, Bard Parker-kniv nr. 15 eller en stump kataraktkniv. Vatpinde er mindre effektive til at fjerne den nekrotiske hornhindeaflejring. Der skal opsamles materiale fra bunden og kanterne af den ulcererede del af cornea gentagne gange. Hvis materialet er blevet strøget på et sterilt medium, kan den samme kniv eller spatel bruges igen til at indsamle yderligere materiale; hvis materialet derimod har været i kontakt med et ikke-sterilt objektglas, skal kniven skiftes, mens spatlen kan flamberes, afkøles og derefter genbruges.

Direkte mikroskopisk undersøgelse af farvede udstrygninger af cornea-skrabemateriale er det hurtigste middel til at stille en formodet diagnose. Septate hyaline hyphaer af filamentøse svampe kan repræsentere arter af Aspergillus, Fusarium eller Acremonium. Der kan også ses farvede septate hyphaer af phaeohyphomyceter som Curvularia. Undertiden er Candida spp. årsag til keratitis, og der kan derfor ses gærsvampe og hyphaer, hvilket tyder på denne diagnose. Konfokal mikroskopi kan være et mere direkte middel til at fastslå diagnosen.

ab
a. hornhindeafskrabning med lactophenol cotton blue viser separate hyfer med Fusarium spp eller Aspergillus spp. Dr. Philip Thomas, Tiruchirappalli ( a &b )
b. En anden hornhindeafskrabning farvet med lactophenol cotton blue viser perleformede septate hyphaer, der ikke er typiske for hverken Fusarium spp. eller Aspergillus spp, og er mere i overensstemmelse med en dematiceøs (dvs. brunfarvet) svamp

Vævs- og peritonealvæsker
Den mikroskopiske påvisning af typiske spirende gærceller, pseudohyphaer og/eller ægte hyfer af Candida-arter i vævsafsnit eller normalt sterile kropsvæsker er tegn på invasiv candidiasis. Typisk producerer C. glabrata kun gærceller, og kun C. albicans producerer ægte hyfer i væv

Gramfarve af en centrifugeret væske (i dette tilfælde urin), der indeholder C. albicans, der viser gær- og hyfeformerne, som så ofte ses i denne type prøver.

Atmeprøver
Sputumundersøgelse er nyttig ved ABPA, da hyphaer ofte kan ses sammen med eosinofile og Charcot Leyden-krystaller. Lejlighedsvis kan ualmindelige svampeinfektioner diagnosticeres ved mikroskopi, når kugler eller store gærsvampe såsom Blastomyces dermatitidis visualiseres. Aspergillus eller andre filamentøse hyphaer kan ses i bronchialvaskmateriale fra svampet tracheobronchitis, undertiden med sporulerende hoveder synlige. Mikroskopi har et højere udbytte end dyrkning i invasiv pulmonal aspergillose fra BAL-prøver, i nogle centre afhængigt af den anvendte metode. Ingen undersøgelser har sammenlignet metoder til mikroskopi eller svampekulturudbytte.

Slimhindeprop undersøgt ved lysmikroskopi med KOH, der viser et netværk af hyaline forgrenede hyphaer, der er typiske for Aspergillus, fra en patient med ABPA.

Det samme præparat af en BAL-prøve, der viser hyaline, septate hyphaer, der er typiske for Aspergillus, farvet med Blankophor til venstre og KOH til højre.

KOH-præparat af en respiratorisk væske, der viser brede ikke-septate hyphaer, typisk for en Zygomycete.

Blodfilm eller knoglemarv

Sensitiviteten af mikroskopi fra blod og knoglemarv er ikke høj nok for de fleste svampeinfektioner til at retfærdiggøre den tid, der bruges på at undersøge prøverne, med undtagelse af dissemineret histoplasmose og Penicillium marneffei, som regel i AIDS.

Mycetom korn

Diagnosen mycetom afhænger af identifikation af korn, som helst skal udtages fra en ubrudt pustel (sinus) ved hjælp af en steril nål. Læsionens tag bør løftes af, og sinusindholdet, herunder eventuelle korn, presses ud og anbringes på et objektglas. Hvert korn skal tages ud, skylles i 70 % alkohol og derefter vaskes i steril saltvand, inden det dyrkes. Direkte mikroskopisk undersøgelse af kornene i 20 % kaliumhydroxid vil bekræfte diagnosen mycetom og vil også afsløre, om den sygdomsfremkaldende organisme er en svamp eller en actinomycet. Sorte korn tyder på en svampeinfektion; små hvide korn tyder ofte på en Nocardiainfektion, og større hvide korn på størrelse med et knappenålshoved kan være af enten svampe- eller aktinomykotisk oprindelse. Små, røde korn er specifikke for Actinomadura pelletieri, men gullige hvide korn kan være af aktinomykotisk eller svampeagtig oprindelse. Aktinomykotiske korn indeholder meget fine filamenter (<1 um i diameter), mens svampekorn indeholder masser af korte sammenfiltrede hyfer (2-4 um i diameter), der undertiden er pigmenterede.

Denning DW, Evans EGV, Kibbler CC, Richardson MD, Roberts MM, Rogers TR, Warnock DW, Warren RE. Fungal nail disease: a guide to good practice (Report of a Working Group of the British Society for Medical Mycology). Br Med J 1995; 311: 1277-1281.

Monod M, Baudraz-Rosselet F, Ramelet AA, Frenk E. Direkte mykologisk undersøgelse i dermatologi: en sammenligning af forskellige metoder. Dermatologica. 1989;179(4):183-6. PMID: 2695355

Procop GW, Haddad S, Quinn J, Wilson ML, Henshaw NG, Reller LB, Artymyshyn RL, Katanik MT, Weinstein MP. Påvisning af Pneumocystis jiroveci i luftvejsprøver ved hjælp af fire farvningsmetoder. J Clin Microbiol. 2004 Jul;42(7):3333-5. PubMed PMID: 15243109; PubMed Central PMCID: PMC446244.