1.4.3.2 Myg
Myg er smittebærere af alvorlige sygdomme hos mennesker som malaria, denguefeber og gul feber, og på trods af bestræbelserne på at bekæmpe dem er de stadig et alvorligt problem. Identifikation af nye myggegener, der er involveret i lugtesans, blodfodring, fordøjelse, reproduktion, immunitet osv. forventes at danne grundlag for udvikling af nye metoder til at kontrollere myggepopulationer og myggebårne sygdomme (Chen et al., 2008).
De nylige genomsekvensoplysninger for tre store myggevektorer, Anopheles gambiae, Aedes aegypti og Culex pipiens quinquefasciatus (http://www.vectorbase.org/), er blevet anvendt til sammenlignende genomforskning og transkriptionsprofilundersøgelser, der gør det muligt at identificere store rækker af nye myggenerver. RNAi er hurtigt blevet det foretrukne værktøj til karakterisering af genfunktion inden for forskellige områder af myggebiologi og interaktioner mellem myg og patogener (f.eks. Fragkoudis et al., 2009). Dette har resulteret i offentliggørelsen af ganske mange funktionelle RNAi-assays i denne organismegruppe, herunder medlemmer af aedinerne (A. aegypti, Armigeres subalbtus og C. pipiens) og anophelines (A. gambiae og Anopheles stephensi). De fleste af disse undersøgelser har imidlertid kun fokuseret på to arter: den vigtigste vektor for denguefeber og gul feber, A. aegypti, og den afrikanske vektor for malaria, A. gambiae (tabel 1.1).
I disse undersøgelser omfattede den typiske eksperimentelle strategi mikroinjektion af dsRNA i thorax af voksne myg efterfulgt af fodring, udfordring med patogener, lugtstoffer, insekticider eller stressende forhold og efterfølgende undersøgelse af myggene for at analysere den fænotypiske effekt af silencing af målgenet på den undersøgte fysiologiske proces, herunder lugtesans, fodring, fordøjelse og metabolisme, stress, afgiftning, kutikeldannelse, reproduktion, immunitet og diapause-regulering. I det følgende præsenterer vi nogle repræsentative undersøgelser af RNAi i myg.
Olfaction medierer en lang række adfærdsmønstre hos både voksne og larver af myg, herunder fødeindtagelse, værtspræference, lokalisering/valg af partner og ynglesteder til æglægning. Olfaction omfatter opfattelse af kemiske stimuli fra lugtmolekyler og udvikling af specifikke reaktioner på sådanne stimuli. Lugtstoffer opfanges af lugtstofbindende proteiner (OBP), som transporterer dem til lugtstofreceptorerne (OR) på dendritiske membraner af olfaktoriske neuroner. Nylige RNAi-målretning af både OBP- og OR-gener har givet værdifulde oplysninger om deres funktion i olfaktionsmekanismen og specificitet (Biessmann et al., 2010; Liu et al., 2010; Pelletier et al, 2010), hvilket åbner mulighed for at ændre olfaktorisk perception og dermed en række adfærdsmønstre, der kan resultere i forebyggelse af myggestik og parring.
I tempererede klimaer overvintrer voksne hunmyg i diapause, en hvileperiode, der er karakteriseret ved fravær af værtssøgende adfærd, ophobning af enorme fedtreserver og et stop for udvikling af æggestokkene. Manipulation af reguleringen af denne hvileperiode kunne f.eks. resultere i induktion af sovende, ikke værtssøgende myg. Dette er blevet illustreret i flere undersøgelser fra Dr. Denlingers hold. Især har de for nylig brugt RNAi til at undersøge diapause-mekanismen i C. pipiens for at påvise, at insulin/FOXO-signalvejen er involveret i reguleringen af diapause (Sim og Denlinger, 2008, 2009a). De har også beviser for inddragelse af nogle fedtsyresyntaser i ophobningen af fedtreserver hos overvintrende hunner (Sim og Denlinger, 2009b) og for den rolle, som ribosomale proteiner S3 og S2 spiller i follikeludviklingen hos ikke-diapauserende hunner (Kim og Denlinger, 2010; Kim et al., 2010).
Vitellogenese og reproduktion er også blevet karakteriseret ved hjælp af RNAi hos myg. I lighed med situationen hos flåter kræver anautogene myg et indtag af hvirveldyrværtsblod for at igangsætte en reproduktionscyklus, der omfatter ægproduktion. De aminosyrer (AA), der stammer fra blodmåltidet, anvendes af myggenes fedtlegeme til at syntetisere æggeblommeproteinprækursorer, hovedsagelig vitellogenin (Vg), i en proces, der kaldes vitellogenese. Vg frigives derefter til hæmolymphen og optages af æggestokkene og deponeres i de udviklende ægceller gennem et specifikt VgR.
I myggen A. aegypti er Vg-genekspressionen blevet intensivt undersøgt af Dr. Raikhels hold i en lang række elegante eksperimenter, hvor de har brugt RNAi som værktøj til omvendt funktionel genomforskning. Dette hold påviste, at Vg-genets transkription er tæt reguleret af de kombinerede input fra flere molekyler, herunder steroidhormonet 20-hydroxyecdyson (20E)-kaskaden og den ernæringsmæssige AA/Target-of-Rapamycin (TOR)-signalering. Denne serin/threoninkinase er ansvarlig for at overføre AA-signalet og aktivere fosforylering af S6-kinase, som er nødvendig for aktivering af translationelle hændelser (Park et al., 2006; Roy og Raikhel, 2011). Endvidere har det samme hold ved at injicere en specifik antagomir produceret RNAi-medieret udtynding af miRNAi miR-27 for at påvise miR-27’s funktion som positiv regulator i både blodfordøjelsen og ægudviklingen. Faktisk reguleres miR-27 i sig selv af 20E- og AA/TOR-vejene (Bryant et al., 2010).
Det medfødte immunsystem hos myggevektorer omfatter tre funktionelle kategorier af gener, der er involveret i patogengenkendelse, signalveje, der medierer signalforstærkning, -modulation og -transduktion, og effektormekanismer, der medierer patogene clearance fra værten (Baton et al., 2008). RNAi er i sig selv en vigtig antiviral immunmekanisme hos myg. I RNA-baseret antiviral immunitet genkendes og forarbejdes viralt dsRNA til siRNA’er af myggen Dicer. Herefter styrer disse virusafledte siRNA’er specifik antiviral immunitet gennem RNAi og relaterede RNA-silens-effektormekanismer (Ding, 2010). Talrige artikler rapporterer om brugen af RNAi til at karakterisere funktionen af myggenes immunitetsgener. Undersøgelser af generelle immunmekanismer og effektorer har fokuseret på mønstergenkendelsesreceptorer, antibakterielle og antifungale signalvejsmolekyler og proteiner, der er involveret i andre cellulære effektormekanismer (gennemgået i Dong et al., 2006; Moita et al., 2005; Shin et al., 2003, 2006; Wang et al., 2006).
RNAi er også blevet anvendt til karakterisering af grænsefladen mellem myg og patogen, og mange undersøgelser har set på immunrelaterede myggemolekyler. Molekylære interaktioner i grænsefladen mellem myg og patogen sikrer overlevelse og udvikling af både patogenet og vektoren. Derfor er det afgørende for udviklingen af nye bekæmpelsesforanstaltninger at forstå de molekylære interaktioner mellem patogener og deres myggevektorer. I det seneste årti er der gjort en intens forskningsindsats for at identificere og funktionelt karakterisere de myggegener, der er involveret i patogeninducerede immunreaktioner, ved hjælp af en række forskellige metoder, herunder komparativ genomforskning, transkriptionsprofilering og RNAi-baseret funktionel analyse (Baton et al., 2008). Disse bestræbelser har primært været fokuseret på to mygge-patogen-sammenslutninger, A. gambiae-Plasmodium sp. og A. aegypti-denguevirus 2 (DENV-2). Myggenes medfødte immunreaktioner på arbovirusinfektion er blevet gennemgået i detaljer af Fragkoudis et al. (2009), og reaktionerne på malariaparasitter er for nylig blevet gennemgået af Brown og Catteruccia (2006) og Baton et al. (2008), herunder RNAi-tilgange.
De fleste af disse RNAi-baserede undersøgelser har været rettet mod gener fra myggenes immunforsvarsmekanismer snarere end mod gener, som patogenerne har brug for for at udvikle sig i myggenes vektor. Med hensyn til de myggeanti-malariagener, der er underkastet RNAi-knock-down, er de fleste af dem involveret i ookinete-drab og melanisering under indtrængning i mellemtarmen (gennemgået i Brown og Catteruccia, 2006; Baton et al., 2008). Med hensyn til de antivirale myggegener, der er underkastet knock-down, er nogle komponenter af signalveje, mens andre udgør en del af det RNAi-baserede antivirale forsvar (gennemgået i Fragkoudis et al., 2009).
I de seneste artikler præsenterer Guo et al. (2010) en nyttig metode til at identificere nye A. aegypti-proteiner, der interagerer med DENV-2. Disse forfattere udviklede det første udkast til myggeproteininteraktionsnetværket ved hjælp af en beregningsmæssig tilgang og identificerede 714 formodede DENV-associerede A. aegypti-proteiner, der er grupperet i fire funktionelle hovedkategorier (replikation/transskription/translation, immunitet, transport og metabolisme). Ti af disse formodede DENV-associerede proteiner blev tilfældigt udvalgt til validering ved RNAi-medieret gensilens, og dengueviraltiteren i myggenes mellemkød blev reduceret signifikant for fem af disse proteiner.
Samlet set støtter disse resultater tanken om, at RNAi kunne være et kraftfuldt værktøj til high-throughput karakterisering af immunsystemet hos insekt-sygdomsvektorer og dermed bidrage til identifikation og karakterisering af potentielle myggemål med henblik på udvikling af nye metoder til at kontrollere myggepopulationer, parasitter i myg og myggebårne sygdomme.
Efter opdagelsen af, at RNAi er en af myggenes vigtigste forsvarsmekanismer mod arbovirus, er det blevet rapporteret, at undertrykkelse af denne vej øger virusbelastningen i inficerede myg (Sanchez-Vargas et al, 2009). Cirimotich et al. (2009) anvendte en Sindbis-virus, der er konstrueret til at udtrykke et protein, der binder til dsRNA og formodentlig beskytter det mod behandling i RNAi-vejen og derved fungerer som en RNAi-undertrykker. Denne manipulerede virus producerer langt flere viruspartikler end normalt i inficerede myg og er dødelig for en række myggearter (A. aegypti, Aedes albopictus, C. trithaeniorhynchus). Denne fremgangsmåde er et eksempel på en ny genetikbaseret udvikling, der potentielt kan være nyttig i “populationsundertrykkelsesstrategier” til myggebekæmpelse (Alphey, 2009).
Det modsatte mål, dvs. kunstig styrkelse af RNAi-baseret antiviral myggeimmunitet for at opnå virusresistente myg, er også blevet udviklet. Antiviral RNAi er blevet anvendt til at give resistens over for DENV i transgene A. aegypti-myg ved at udtrykke et hårnåle-RNA, der svarer til et fragment af viruset (Franz et al., 2009). Ved hjælp af vævs- og tidsspecifikke promotorer kan ekspressionen af hairpin RNA begrænses til mellemtarmen – de første celler, der inficeres – og kun efter blodmåltidet, hvilket minimerer potentielle problemer for myggenes fitness, der er afledt af den konstitutive ekspression af et lang-hairpin RNA. En diskussion om fordelene og problemerne ved at anvende denne type transgene resistente myggestammer i “populationserstatningsstrategier” til myggebekæmpelse kan findes i Alphey (2009).