Formaldehyd-Fixiermittel

Informationen zu 37%igem Formaldehyd

Es gibt kein definitives Alter, nach dem 37%iges Formaldehyd nicht mehr als Stammlösung brauchbar ist. Die Formaldehydchemie ist mäßig komplex, aber nach Gesprächen mit anderen Mikroskopikern, Herstellern und der Durchsicht einschlägiger Texte sind die folgenden Beobachtungen zutreffend.

• Formaldehyd sollte bei Raumtemperatur gelagert werden (kalte Temperaturen fördern die Bildung von Trioxymethylen mit einem daraus resultierenden weißen Niederschlag)
• Formaldehyd sollte dicht verschlossen gelagert werden, da die Einwirkung von Luft die Oxidation von Formaldehyd zu Ameisensäure fördert (37%iges Formaldehyd wird in der Regel mit 10-15% Methanol versandt, um diese Veränderung zu hemmen).

Unsere Empfehlung zu 37%igen Stammlösungen: Wenn eine 37%ige Formaldehydlösung klar, farblos und ohne Ausfällungen ist und bei Raumtemperatur in einer dicht verschlossenen Flasche gelagert wurde, die nicht dem Sonnenlicht ausgesetzt war, sollte sie in Ordnung sein. Bereits geöffnete Flaschen mit 37%igem Formaldehyd sollten nicht länger als sechs Monate verwendet werden. Daher empfehlen wir den Labors, ihr Formaldehyd häufiger und in kleineren Mengen zu kaufen, als sie es vielleicht in der Vergangenheit getan haben.

Die Verwendung von 37%igem Formaldehyd wird für Fixiermittel in der Elektronenmikroskopie nicht empfohlen. Entweder ein höherwertiges, methanolfreies Formaldehyd oder eine frische Lösung aus Paraformaldehyd ist eine viel bessere Wahl (siehe weitere Kommentare unten).

Informationen über 10%iges Formalin

Das Fixiermittel 10%iges gepuffertes Formalin wird in vielen Labors zur Konservierung von Geweben für die Routine-Histologie verwendet. Das Formaldehyd hat in dieser Konzentration des Gewebefixiermittels eine größere Chance zur Oxidation, so dass der pH-Wert der Lösung trotz des Puffers schließlich abfällt. Wir empfehlen, 10%ige gepufferte Formalinlösungen nicht länger als 3 Monate nach dem ersten Anmischen zu verwenden. Die Lösung sollte klar, farblos und ohne Ausfällungen sein, und der pH-Wert sollte nicht unter 6,5 liegen.

Das andere Problem bei 10% gepuffertem Formalin ist die langsam ansteigende Konzentration von Methanol (ein unerwünschtes Nebenprodukt des alternden Formaldehyds). Methanol fördert die Verklumpung von Proteinen anstelle der Vernetzung von Proteinen, die durch Formaldehyd bewirkt wird. Ein methanolfreies Fixiermittel bietet die beste Konservierung, insbesondere wenn das Gewebe später für Antikörperfärbungen verwendet werden soll.

Die gängigste Methode, Methanol in einer Formaldehydlösung zu vermeiden, besteht darin, die Lösung aus kristallinem Paraformaldehyd frisch herzustellen. Paraformaldehyd kann sehr gefährlich sein, und es ist oft schwierig, es in Lösung zu bringen. Wenn Ihr Labor nicht regelmäßig Formaldehyd-Fixiermittel verwendet, gibt es einige einfachere Möglichkeiten, die wir empfehlen.

Eine Möglichkeit ist der Kauf von methanolfreiem Formaldehyd (aq) in versiegelten Ampullen. Geben Sie einfach PBS hinzu, um die richtige Formaldehydkonzentration zu erreichen, und verwenden Sie es sofort. Zehn 10-ml-Ampullen mit 16 % methanolfreiem Formaldehyd kosten etwa 27 $.

Die andere Möglichkeit besteht darin, 10 % neutral gepuffertes Formalin (4 % Formaldehyd) in einem wissenschaftlichen Fachgeschäft zu kaufen, es 3 bis 6 Monate lang zu verwenden und dann zu entsorgen (als Gefahrgut). Diese Lösung enthält zwar etwas Methanol (in der Regel 1-2 %), aber wenn sie bald nach dem Kauf verwendet wird, dürfte dies für die meisten Benutzer keine Rolle spielen. Die gepufferte Lösung hilft, den Säuerungsprozess zu verlangsamen. Eine Ein-Liter-Flasche kostet etwa $20-25. Lagern Sie das Fixiermittel bei Raumtemperatur. Lokale Leser dieser Seite sollten sich mit dem CMM Histology Service Lab (626-4415) in Verbindung setzen, wenn sie Schwierigkeiten haben, einen Lieferanten zu finden. (Bitte beachten Sie, dass verschiedene Anbieter unterschiedliche Pufferlösungen verwenden. Für eine konsistente Immunhistochemie und/oder Immunfluoreszenz sollten die Benutzer bei einem Lieferanten bleiben).

Einige Labors haben nach der Verwendung von ungepuffertem 10%igen Formalin gefragt. Sofern es keinen besonderen Grund für diese Wahl gibt, raten wir davon ab, da dieses Fixiermittel schnell sauer wird. Von einer Lagerung des Gewebes in diesem Fixiermittel über mehrere Stunden hinaus ist dringend abzuraten.

Empfehlungen für die optimale Fixierung von Proben

Gewebeproben sollten so schnell wie möglich in Fixiermittel eingelegt werden, nachdem sie einem Tier entnommen wurden, das Fixiermittel sollte mindestens das 20-fache des Volumens des Gewebes betragen und das Fixiermittel sollte nach der ersten Stunde der Fixierung gewechselt werden.

Das Gewebe sollte so geschnitten werden, dass die dünnste Abmessung nicht mehr als 4-5 mm dick ist (die Formalinpenetration ist langsam, ca. 0,5 mm/Stunde). Dies entspricht ungefähr der Dicke von zwei US-Vierteln. Wenn das Gewebe oder Organ eine dicke Kapsel hat (z. B. eine Niere), sollte der Benutzer beachten, dass das Fixiermittel nicht so schnell durch die Kapsel dringt. Zu dicke Proben können auf der Außenseite überfixiert und auf der Innenseite schlecht fixiert sein, was zu Interpretationsproblemen aufgrund von Färbungsartefakten führt.

Die anfängliche Fixierung sollte bei Raumtemperatur erfolgen, da die Penetration von Formalin von der Temperatur der Lösung abhängt. Das Formalin sollte vor der Verwendung leicht geschüttelt werden, um einen Konzentrationsgradienten in der Flasche zu vermeiden.

Die Dauer der Fixierung hängt in gewissem Maße von der Dicke des Gewebes ab.

• Monolayer aus kultivierten Zellen müssen nicht lange fixiert werden, in der Regel sind 15-30 Minuten ausreichend. Die kultivierten Zellen sollten nach der Fixierung in das vom Labor des Anwenders verwendete Protokoll für Immunhistochemie/Immunfluoreszenz überführt werden.
• Gewebe und Organe sollten (je nach Größe) für 2 bis maximal 24 Stunden fixiert werden. Danach können die Gewebe für kurze Zeit (vorzugsweise nicht länger als 3 Tage) in 70%igem Ethanol (aq) gelagert werden. Eine längere Lagerung in einer der beiden Lösungen kann dazu führen, dass das Gewebe zu hart wird und sich die Paraffinblöcke nur schwer schneiden lassen.

Die sorgfältige Einhaltung eines standardisierten Fixierungsprotokolls führt zu den beständigsten Ergebnissen.

Formalin vs. Formaldehyd

Gelegentlich stoßen wir auf Verwirrung über den Unterschied zwischen Formaldehyd und Formalin. Dies ist ein verständliches Problem, da die Begriffe manchmal austauschbar verwendet werden. Es ist nicht korrekt, die beiden Begriffe auf diese Weise zu verwenden. Die Konzentrationen der chemischen Fixiermittel, für die die beiden Bezeichnungen stehen, sind recht unterschiedlich.

Ein Fixiermittel, das als 10%iges gepuffertes Formalin bezeichnet wird, ist in Wirklichkeit nur eine 4%ige Lösung von Formaldehyd. Das liegt daran, dass 10% gepuffertes Formalin ein Beispiel für den alten Histologenjargon ist, der eine 10%ige Lösung beschreibt, die aus einer Vorratsflasche mit 37-40% Formaldehyd hergestellt wurde (oder genauer: eine 3,7-4%ige Lösung von Formaldehyd).

Formaldehydsicherheit

Die United States Occupational Safety and Health Administration (OSHA) ist sehr besorgt über Formaldehyd. Wenn Sie in Ihrem Labor kein aktuelles Sicherheitsdatenblatt (MSDS) für Formaldehyd haben, können Sie eines im SIRI MSDS-Archiv finden.

Bitte seien Sie sich der Gefahren bewusst, die von Formaldehyd ausgehen. Die folgende Aussage stammt aus einem Sicherheitsdatenblatt für 10% gepuffertes Formalin:

“GEFAHR! KANN BEI VERSCHLUCKEN TÖDLICH SEIN. SCHÄDLICH BEIM EINATMEN ODER BEI AUFNAHME DURCH DIE HAUT. VERURSACHT REIZUNGEN AN HAUT, AUGEN UND ATEMWEGEN. STARK SENSIBILISIEREND. KANN ERBLINDUNG VERURSACHEN. BRENNBARE FLÜSSIGKEIT UND DÄMPFE. VERDACHT AUF KREBSGEFAHR. ENTHÄLT FORMALDEHYD, DAS KREBS ERZEUGEN KANN. Das Krebsrisiko hängt von der Dauer und dem Ausmaß der Exposition ab.”

(für lokale Leser) Die Abteilung für Risikomanagement der Universität von Arizona bietet ein Selbststudienprogramm mit dem Titel “Hazard Communication Training for Formaldehyde” an. Dieser Leitfaden führt Sie in alle relevanten Aspekte der OSHA-Formaldehydnorm von 1992 ein. Laut Risikomanagement “ist eine jährliche Schulung für Personen erforderlich, die Formaldehydlösungen von mehr als 0,1 % oder Materialien verwenden, die mehr als 0,1 ppm Formaldehyd freisetzen können.” Dazu gehören die meisten von uns, die Formaldehyd für histologische oder elektronenmikroskopische Fixiermittel verwenden.

Um ein Exemplar des Handbuchs “Hazard Communication Training for Formaldehyde” zu erhalten, wenden Sie sich bitte direkt an die Abteilung für Risikomanagement und Sicherheit (621-1570, nur für Fakultätsangehörige, Mitarbeiter und Studenten der University of Arizona).

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