Mikroskooppi on välttämätön monilla mykologian osa-alueilla. Sillä on 3 pääasiallista käyttötarkoitusta:

1. Sienten havaitseminen suoraan kliinisistä näytteistä – erityiset ulkonäöt voivat olla hyvin tyypillisiä tietyille infektioille, esim. zygomykeetti-infektio tai India Ink aivo-selkäydinnesteessä. Suora mikroskooppitutkimus, jos se on positiivinen, on nopeampi kuin viljely.
2. Vahvistus siitä, että ilmateitse leviävän sienen, kuten Aspergilluksen, viljely on infektion aiheuttaja ja että se ei todennäköisesti ole kontaminaatio.
3. Sienten tunnistaminen morfologisten ulkonäköjen perusteella.

Alempana oleva jakso on varsin tekninen ja spesifinen, ja se on kirjoitettu laboratoriotyöntekijälle, joka haluaa parantaa toteamisprosenttia ja raportointitaitoja.

Tässä taulukossa esitetään tärkeimmät näytetyypit ja löydökset, joita käytetään suorassa mikroskopoinnissa.

Näyte	Sienten havaittavuus ja ulkonäkö
CSF	Cryptococcus	Kryptococcus-sienten itiöemät	Intian musteen valmiste.
Hiuksista, kynsistä ja ihosta otetut kaavinnat	Dermatofyyttien tai muiden säikeisten sienten hyypät Candida-sienien hyypät	Erilaisia sieniä ei voida erottaa. Viljelyt usein negatiivisia, joten mikroskooppitutkimus ainoa todiste infektiosta.
Nenän sivuonteloiden limakalvoista peräisin oleva lima	Limakalvoissa havaittavissa olevat hyypät ovat eosinofiilisen sieniperäisen nenän sivuontelotulehduksen diagnostiikka	Limakalvot on kiinnitettävä, ja ne on värjättävä samoin kuin histopatologiset leikkeet. Hyfat voivat olla vaikeasti havaittavissa.
Korvan roskat/kaapiminen	Hyfat, yleensä Aspergillus nigerille tyypillisiä itiöpäätä.	Sekoittuu toisinaan Candida- ja hiivasoluja.
Sarveiskalvon kaavinta keratiitin varalta	Voi näkyä itiöitä tai säikeisiä sieniä	Hyödyllinen mykoottisen keratiitin varhainen merkki, ei erota aiheuttajalajia
Kudosaspiraatio tai biopsia	Hyytelöityjä säikeisiä sieniä Candida- tai muita hiivasieniä. C. immitis -sienen sienirakkuloita	Joitakin hyvin erottuvia sieniä, mukaan lukien pieniä hiivoja, joissa ei ole hyfoja, jotka viittaavat C. glabrataan, tai zygomykeettien ei-septisiä hyfoja.
Hengitysnesteet	Hyönteiset, joilla ei ole merkitystä Hyönteiset (ilman hiivoja), jotka sopivat tautiin Pneumocystis jirovecii	Hyönteiset tavallisesti septattuja ja tyypillisiä Aspergillukselle, mutta jos ne eivät ole septisiä, harkitaan zygomykoosia tai mucormykoosia. Imuunofluoresenssi ylivoimainen P. jirovecii:lle
Verikalvo tai luuydin	Histoplasmalle tai harvoin Penicilliumille tyypillisiä solunulkoisia hiivoja	Tunnuspiirre disseminoituneessa histoplasmoosissa, ja sitä tavataan 40 %:ssa.
Peritoneaalineste	Hiivat tai harvoin hyfat	Hyödyllinen Candida-taudin varmistamisessa. vatsakalvontulehdus
Emättimen pyyhkäisy/maaläiskäyte	Candida albicans (hiiva ja hyfat) tai Candida glabrata	Key diagnostinen testi
Mycetoma grain	May show hyphae with characteristics	Usually not definitive with respect to species

Staining methodology

Vanhin spesifinen preparaatti mikroskooppia varten on väkevöityä (10-20 %) kaliumhydroksidiliuos, joka pehmentää keratiinia ja mahdollistaa sienten suoran visualisoinnin ja jonkin verran morfologian arviointia. Gram-värjäykset ovat vähemmän herkkiä. Papanicolau-värjäyksistä voi olla hyötyä. Sytologiset objektilasit voidaan värjätä sliver- tai Gomori Methenamine Silver (GMS) -värjäyksillä. Immunofluoresenssimikroskopia on paras menetelmä Pneumocystiksen havaitsemiseksi. Fluoresoivat kirkasteet (Calcofluor white, Blankophor tai Tinopal UNPA-GX), jotka sitoutuvat sienen soluseinän kitiiniin, ovat nopea keino skannata näytteitä sienihyfojen varalta ja parantaa morfologian arviointia.

Mikroskopian diagnostinen rooli tietyissä sairauksissa

CSF ja aivokalvontulehdus

Kapseloituneet Cryptococcus-solut voidaan usein havaita CSF:n tai muiden isännän nesteiden tai eritteiden näytteistä, jotka on kiinnitetty tussilla. Noin 50 %:lla HIV-negatiivisista ja yli 80 %:lla HIV-positiivisista potilaista aivoselkäydinnesteen tussitutkimus on positiivinen. Erityisesti ehjät lymfosyytit voidaan kuitenkin sekoittaa organismiin. AIDS-potilailla Cryptococcus-soluja on yleensä runsaasti CSF:ssä, vaikka kapselit voivat olla pieniä, mikä vaikeuttaa tunnistamista. Jatkuvasti positiivisia aivoselkäydinlöydöksiä hoitoa saavilla potilailla olisi pidettävä todisteena hoidon epäonnistumisesta tai uusiutumisesta vain, jos ne vahvistetaan potilaan kliinisen tilan heikkenemisellä tai positiivisilla viljelmillä.

Intiamustepreparaatti CSF:stä, jossa näkyy useita hiivoja, joilla on suuret kapselit ja kapeat nuput pienempiin tytärsoluihin, jotka ovat tyypillisiä C. neoformans -bakteerille

Transmissioelektronimikroskooppikuva AIDS-potilaan CSF:ssä havaitusta C. neoformans -hiivasolukosta, jossa on huomattavan vähän kapselia. Näitä soluja voidaan erehtyä luulemaan lymfosyyteiksi.

Hermokalvontulehduspotilaan aivoselkäydinnesteessä esiintynyt filamenttinen sieni, joka kasvoi myöhemmin Candida albicans -bakteeria viljelyssä.

Hiukset

Päänahasta otettaviin näytteisiin tulisi kuulua hiusjuuria, tukkeutuneiden follikkelien sisältöä ja ihokarvoja. Favusta lukuun ottamatta tartunnan saaneiden hiusten distaalinen osa sisältää harvoin sieniä. Tästä syystä leikatut hiukset, joissa ei ole juuria, eivät sovellu mykologiseen tutkimukseen. Yksi menetelmä, joka on käyttökelpoinen materiaalin keräämiseksi päänahasta, on hiusharjalla tapahtuva näytteenotto.

Tartunnan saaneen materiaalin suorassa mikroskooppitutkimuksessa pitäisi havaita dermatofyytin artrokonidioita, jotka sijaitsevat tartunnan saaneen hiuksen ulkopuolella (ectothrix) tai sisällä (endothrix). Artrokonidia voi olla kooltaan joko pieni (halkaisija 2-4 um) tai suuri (halkaisija enintään 10 um). Ihon suomut sisältävät hyfoja ja artrokonidioita. T. schoenleinii -infektiossa (favus) tartunnan saaneissa karvoissa näkyy irrallisia artrokonidien ketjuja ja ilmatiloja. Scutulum (kuori) koostuu myseelistä, neutrofiileistä ja epidermissoluista.

Ihon kaavinta, jossa näkyy filamenttisia hyfoja, joissa on blankoforia.

Kynnet

Otetun näytteen laatu on merkittävä tekijä mikroskopoinnin ja viljelyn onnistumisessa. Näytteen ottamisen pitäisi olla kivutonta lukuun ottamatta satunnaista lievää epämukavuutta, kun näytteitä otetaan kynnestä. Alla olevassa kuvassa on esitetty sopivat kohdat, joista kynsinäytteet tulisi ottaa,

Tylpällä skalpellilla otetut näytteet tai leikkeet tulisi kuljettaa taitellussa paperineliössä, joka on mieluiten kiinnitetty paperiliittimellä, mutta saatavilla on myös kaupallisia mykologisia pakkauksia. Laboratoriossa osaan näytteestä lisätään 20-30-prosenttista kaliumhydroksidiliuosta kynsikeratiinin maseroimiseksi, jotta näytteestä voidaan tutkia sienieläimiä suoralla mikroskopialla. Vaihtoehtoisesti osa kustakin näytteestä tutkitaan fluorokromia sisältävässä kynsiliuoksessa. Esimerkki reaktiivisesta liuoksesta on tämä. Se valmistetaan liuottamalla 1 g Na2S 7,5 ml:aan tislattua vettä ja lisäämällä 2,5 ml etanolia. Tämän jälkeen tähän seokseen lisätään 10 ml Blankophoria tai 20 ml 1-prosenttista vesiliuosta Tinopal UNPA-GX:ää (fluoresoiva kirkaste 28, F3543; Sigma).

Nenäonteloiden limakalvot

Allergisen sieniperäisen rinosinuiitin (AFRS) diagnostinen piirre on potilaan nenästä tai nenän sivuonteloista kerättyjen eosinofiilisten, hyfoja sisältävien limakalvojen esiintyminen ilman viitteitä sienen kudosinvaasiosta. Hyfat voivat olla harvalukuisia sivuonteloiden sisällössä, ja niiden havaitseminen nykyisin käytetyillä värjäysmenetelmillä vie paljon aikaa. Ilman tätä positiivista piirrettä tehdään yleensä muita diagnooseja, kuten allerginen rinosinuiitti (ARS) tai eosinofiilinen mukiinirinosinuiitti (EMRS). Paljon herkempien diagnostisten tekniikoiden, kuten kitiinivärjäyksen tai spesifisten anti-Alternaria-immunofluoresenssivärjäysten käyttö voi kuitenkin parantaa herkkyyttä. Tukevia diagnostisia piirteitä ovat Charcot-Leydenin kiteiden esiintyminen, luinen eroosio ja heterogeeninen sameus, johon liittyy sivuontelon laajeneminen tietokonetomografiassa.

Korvakäytävä- ja ulkokorvatulehdus

Korvakäytävästä on saatava likaa ja eritettä. Suora mikroskooppinen tutkimus paljastaa haarautuvia hyfoja, orastavia hiivasoluja tai molempia. Aspergillus-infektiotapauksissa voidaan joskus nähdä tyypillisiä itiöpäätä.

Keratiitin sarveiskalvon kaavinta

Sieniperäinen keratiitti on lääketieteellinen hätätilanne, ja se on tunnistettava ja hoidettava viipymättä. Mikrobiologista diagnoosia varten paras näyte on materiaali sarveiskalvon sairastuneesta osasta; materiaali voidaan kerätä kaavintana haavaantuneelta alueelta tai biopsiana, kun sarveiskalvon epiteeli on ehjä ja infektio rajoittuu sarveiskalvon stroomaan. Sarveiskalvosta otetaan kaavinta käyttäen instrumenttia, kuten platinaspatulaa, Beaver-terää, Bard Parker -veitsiä nro 15 tai tylppää kaihiveitsiä. Pumpulipuikot eivät ole yhtä tehokkaita sarveiskalvon nekroottisen sarveiskalvon kuona-aineen poistamisessa. Materiaalia on kerättävä toistuvasti sarveiskalvon haavaantuneen osan pohjalta ja reunoilta. Jos materiaalia on levitetty steriilille alustalle, samaa terää tai lastaa voidaan käyttää uudelleen lisämateriaalin keräämiseen; jos materiaali on kuitenkin joutunut kosketuksiin ei-steriilin mikroskooppilasialustan kanssa, terä on vaihdettava, kun taas lastaa voidaan liekittää, jäähdyttää ja käyttää uudelleen.

Sarveiskalvon kaavintamateriaalin värjättyjen preparaattien suora mikroskooppinen tutkiminen on nopein keino tehdä oletusdiagnoosi. Nähdyt filamenttisten sienten septiset hyaliinihyfeet voivat edustaa Aspergillus-, Fusarium- tai Acremonium-lajeja. Curvularian kaltaisten faeohyphomycetes-sienien värillisiä septisiä hyfoja voi näkyä. Toisinaan Candida spp. on keratiitin aiheuttaja, joten hiivoja ja sienihyfoja voi näkyä, mikä viittaa tähän diagnoosiin. Konfokaalimikroskopia voi olla suorempi keino diagnoosin vahvistamiseksi.

ab
a. Sarveiskalvon kaavinta laktofenolivattasinisella näyttää erillisiä hyfoja, joissa on Fusarium spp. tai Aspergillus spp. Dr. Philip Thomas, Tiruchirappalli ( a &b )
b. Toinen sarveiskalvon kaavinta, joka on värjätty laktofenoli-puuvillansinisellä, jossa näkyy helmimäisiä septisiä hyfoja, jotka eivät ole tyypillisiä Fusarium spp:lle tai Aspergillus spp:lle, pikemminkin sopivat dematiceoottiseen (eli ruskean väriseen) sieneen

Kudos- ja vatsakalvonesteet
Tyypillisten orastavien hiivasolujen, pseudohyfojen ja/tai Candida-lajien todellisten hyfojen havaitseminen kudosleikkeistä tai normaalisti steriileistä ruumiin nesteistä mikroskooppisesti on merkki invasiivisesta kandidiaasista. Tyypillisesti C. glabrata tuottaa kudoksissa vain hiivasoluja, ja vain C. albicans tuottaa todellisia hyfoja

Grammavärjäys sentrifugoidusta nesteestä (tässä tapauksessa virtsasta), joka sisältää C. glabrata -bakteeria. albicansia, jossa näkyvät hiiva- ja hyfamuodot, joita niin usein nähdään tämäntyyppisissä näytteissä.

Hengitysnäytteet
Sputumin tutkiminen on hyödyllistä ABPA:ssa, sillä hyfat näkyvät usein eosinofiilien ja Charcot Leydenin kiteiden kanssa. Toisinaan harvinaisia sieni-infektioita voidaan diagnosoida mikroskoopilla, kun palloja tai suuria hiivoja, kuten Blastomyces dermatitidis, saadaan näkyviin. Sieniperäisen trakeobronkiitin keuhkoputkien pesuaineessa voi näkyä Aspergillus- tai muita filamenttisia hyfoja, ja joskus niissä voi näkyä itiöpäätä. Mikroskoopilla saadaan BAL-näytteiden invasiivisessa keuhkoaspergilloosissa suurempi saanto kuin viljelyllä, joissakin keskuksissa käytetystä menetelmästä riippuen. Mikroskooppimenetelmiä tai sieniviljelyn saantoa ei ole vertailtu tutkimuksissa.

Valomikroskopoimalla KOH:lla tutkittu limakalvotulppa, jossa näkyy Aspergillukselle tyypillisten hyaliinihyfojen verkosto, ABPA-potilaalta.

Sama BAL-näytteen preparaatti, jossa näkyy Aspergillukselle tyypillisiä hyaliinisia, septisiä hyfoja, värjätty vasemmalla Blankophorilla ja oikealla KOH:lla.

KOH-preparaatti hengitystietulehduksesta, jossa näkyy leveät epäseptiset hyfat, jotka ovat tyypillisiä zygomykeeteille.

Verikalvo tai luuydin

Verestä ja luuytimestä otetun mikroskopian herkkyys ei ole useimpien sieni-infektioiden kohdalla niin suuri, että näytteiden tutkimiseen käytettäisiin niin paljon aikaa kuin olisi perusteltua; poikkeuksena ovat disseminoitunut histoplasmoosi ja yleensä AIDS:n yhteydessä esiintyvä Penicillium marneffei.

Myketoomajyvä

Myketooman diagnoosi riippuu jyvien tunnistamisesta, jotka olisi mieluiten otettava puhkeamattomasta märkärakkulasta (sinus) steriilillä neulalla. Vaurion katto on nostettava pois ja sinuksen sisältö, mukaan lukien mahdolliset jyvät, puristettava ulos ja asetettava lasilevylle. Jokainen jyvä on poimittava, huuhdeltava 70-prosenttisessa alkoholissa ja pestävä steriilillä suolaliuoksella ennen viljelyä. Jyvien suora mikroskooppitutkimus 20-prosenttisessa kaliumhydroksidissa vahvistaa mykeettidiagnoosin ja paljastaa myös, onko aiheuttajaorganismi sieni vai aktinomykeetti. Mustat jyvät viittaavat sieni-infektioon; pienet valkoiset jyvät viittaavat usein Nocardia-infektioon, ja suuremmat, nuppineulanpään kokoiset valkoiset jyvät voivat olla joko sieni- tai aktinomykoottista alkuperää. Pienet, punaiset jyvät ovat tyypillisiä Actinomadura pelletieri -bakteerille, mutta kellertävänvalkoiset jyvät voivat olla aktinomykoottisia tai sieniperäisiä. Aktinomykoottiset jyvät sisältävät hyvin hienoja säikeitä (<1 um halkaisijaltaan), kun taas sienijyvät sisältävät lyhyiden kietoutuneiden hyfojen massoja (2-4 um halkaisijaltaan), jotka ovat joskus pigmentoituneita.

Denning DW, Evans EGV, Kibbler CC, Richardson MD, Roberts MM, Rogers TR, Warnock DW, Warren RE. Fungal nail disease: a guide to good practice (Report of a Working Group of the British Society for Medical Mycology). Br Med J 1995; 311: 1277-1281.

Monod M, Baudraz-Rosselet F, Ramelet AA, Frenk E. Direct mycological examination in dermatology: a comparison of different methods. Dermatologica. 1989;179(4):183-6. PMID: 2695355

Procop GW, Haddad S, Quinn J, Wilson ML, Henshaw NG, Reller LB, Artymyshyn RL, Katanik MT, Weinstein MP. Pneumocystis jiroveci -bakteerin osoittaminen hengitystietutkimusnäytteistä neljällä värjäysmenetelmällä. J Clin Microbiol. 2004 Jul;42(7):3333-5. PubMed PMID: 15243109; PubMed Central PMCID: PMC446244.

.