Lorsqu’il s’agit de faire pousser des colonies bactériennes, le LB-agar monte sur la plaque – mais il faut d’abord le mettre à l’état de gel (une situation à laquelle son ami l’agarose peut sûrement s’identifier !Le “-ose” est une terminaison généralement utilisée pour indiquer qu’il s’agit d’un sucre. L’agarose est un sucre, mais l’agar aussi ! Quelle est donc la différence ? Ils sont apparentés, mais ils diffèrent par plus que quelques lettres et ces différences les rendent utiles pour faire des matrices de gel pour différentes tâches – des gels d’agarose pour séparer des fragments d’ADN par taille et des plaques de gel d’agar pour cultiver des bactéries)
Un gar est une chose qui ressemble à un poisson et l’AGAR (alias agar-agar (sérieusement !)) est un mélange de 2 sucres – agaropectine & celui que nous connaissons mieux, l’agarose. On obtient donc l’agarose en purifiant l’agar. Et pour comprendre pourquoi on se donne ce mal parfois, mais pas d’autres fois, il est utile d’en savoir un peu plus sur ce que sont ces sucres.
L’agarose est un polysaccharide (“poly” signifie beaucoup de &sucre de saccharide, donc un polysaccharide est une longue chaîne de sous-unités de sucre répétitives jointes ensemble). C’est un exemple de polymère. Les polymères sont de longues chaînes de sous-unités répétitives. Différents polymères ont des sous-unités de différents types (par exemple, les sous-unités de nucléotides se lient pour vous donner les polymères que nous appelons ADN ou ARN ; les acides aminés s’unissent pour former des protéines ; et les sucres monosaccharides s’enchaînent pour donner des glucides complexes (comme l’agarose !))
Les sucres ont beaucoup de groupes hydroxyle (-OH) (auxquels l’eau se colle volontiers, vous aidant à former un gel – une maille polymère interconnectée “à l’infini” (comme 7° de Kevin bacon) contenant de l’eau. (plus à venir)). Les unités de sucre individuelles (monosaccharides) adoptent souvent des structures cycliques (comme c’est le cas dans l’agarose) dans lesquelles les groupes -OH dépassent comme des jambes. Les sucres peuvent avoir la même “liaison”, mais les groupes liés dépassent de différentes manières & nous utilisons “L” et “D” pour désigner la direction dans l’espace vers laquelle pointent les jambes. Plus d’informations sur une telle stéréochimie ici : bit.ly/2Q8Dnax
Les monosaccharides peuvent utiliser leurs -OH pour se lier entre eux. En liant 2, vous obtenez un disaccharide . Ajoutez-en un peu plus et vous obtenez des oligosaccharides (oligo signifie peu). Liez-en beaucoup et vous obtenez un polysaccharide (poly signifiant beaucoup).
Et en parlant de beaucoup, les multiples -OH signifient qu’il y a plusieurs sites de liaison potentiels (que nous spécifions par le nombre d'”adresses” sur les anneaux de sucre qui sont joints). Vous pouvez obtenir des “ramifications”, mais dans l’agarose, vous avez des chaînes linéaires (d’environ 400 sous-unités). (Bien que des ramifications puissent être introduites en utilisant des “réticulants” pour renforcer l’agarose afin qu’il puisse faire des choses comme fabriquer de la résine de chromatographie d’exclusion de taille (“filtration sur gel”) qui peut résister aux hautes pressions générées en FPLC (Fast performance liquid chromatography).
Dans l’agarose, la sous-unité répétitive est un duo de sucre (disaccharide) de galactose (D-galactose pour être précis) lié à un monosaccharide de galactose modifié, le 3,6-anhydro-L-galactose. On appelle ce duo AGAROBIOSE (En liant un galactose à un glucose, on obtient le lactose, un disaccharide que vous connaissez peut-être mieux).
Dans le galactose, les anneaux ont 6 côtés avec 4 pattes -OH, 5 pattes -H, & 1 patte méthylhydroxyle (-CH₂OH). Souvent, on ne dessine pas les pattes “-H” car elles cachent les pattes plus intéressantes qui sont capables de réagir. Dans le galactose modifié de l’agarose, 2 des groupes -OH se sont liés & ont viré un hydrogène (“anhydro”) de sorte que le bras méthylhydroxyle est ponté à un bras -OH formant un “pont” sur l’anneau.
Environ 2/3 de l’agar est de l’agarose mais, l’agar contient aussi de l’AGAROPECTINE. Elle est vraiment similaire (elle a des galactoses D &L alternés) MAIS beaucoup de ces galactoses ont des modifications. Il y a plusieurs modifications différentes, y compris l’ajout de sulfate(s), d’acide pyruvique ou de groupes méthyles, ou l’introduction furtive d’une de ces versions à branches liées comme dans l’agarose.
Contrairement à la nature répétitive constante de l’AGAROSE, c’est seulement le “squelette” de galactose D- & L- alterné qui est constant dans l’agaropectine. Ses modifications sont dispersées tout au long de la chaîne (par exemple, environ chaque 10ème est attaché à un sulfate par une liaison -O-sulfate, mais ce n’est qu’une moyenne, et il est peu probable qu’ils soient précisément, uniformément, distribués). Et, alors que les chaînes ont tendance à être plus courtes que les chaînes d’agarose, leur longueur est également variable, donc, l’agaropectine est vraiment tout un mélange & vous ne savez jamais tout à fait ce que vous allez obtenir !
Pourquoi utiliser l’un plutôt que l’autre ?
L’ADN a beaucoup de groupes phosphates chargés négativement (phosphore entouré de 4 oxygènes). Cela leur servira de base pour se déplacer dans le gel vers l’extrémité positive. Nous avons donc besoin que le gel soit neutre.
L’ADN a beaucoup de groupes sulfates (soufre entouré d’oxygènes). Ceux-ci sont également chargés négativement, ils peuvent donc interférer avec la façon dont l’ADN se déplace dans le gel. Il ferait donc une mauvaise matrice pour l’électrophorèse.
Mais l’agarose est neutre, ce qui en fait une bonne matrice pour l’électrophorèse.
Mais l’agarose est aussi plus cher car il doit être purifié. Donc si vous n’avez pas besoin de vous soucier de la question de la charge physique, autant utiliser quelque chose qui a une charge *monétaire* plus faible ! Parce que l’agar nécessite moins de traitement, il est moins cher &parfait pour être utilisé comme matrice pour contenir la nourriture des bactéries !
Dans les plaques d’agar, ce n’est pas l’agar lui-même qui fournit des nutriments. C’est l’une des grandes choses de l’agar – *la plupart* des bactéries ne peuvent pas le manger. La gélose fournit simplement un “échafaudage” pour accueillir les nutriments dont les bactéries ont besoin. Et souvent, ces nutriments sont fournis par un “milieu de croissance” bactérien liquide appelé LB, qui, quoi qu’en disent vos manuels, signifie (à l’origine du moins) bouillon de lysogénie. Parfois, les initiales de Luria, Lennox ou Luria & Bertani sont créditées de ce nom, mais il s’agit en réalité du LYSOGENY BROTH et sa recette a été publiée pour la première fois (par Giuseppe Bertani) en 1951. Il l’utilisait pour étudier la lysogénie (processus par lequel un virus infectant les bactéries, appelé bactériophage (“phage”), insère son propre ADN dans l’ADN d’une bactérie &attendant son heure jusqu’à ce que les conditions soient réunies pour entrer dans le phage lytique où il se découpe, fait beaucoup de copies et éclate la cellule) http://bit.ly/2HLuB1S
Le but du LB est essentiellement de donner aux bactéries ce dont elles ont besoin pour croître, se diviser et faire ce que nous voulons (comme faire des copies de l’ADN que nous mettons en elles et/ou faire des copies de protéines en utilisant les instructions de l’ADN que nous mettons en elles). Et de le faire à moindre coût.
Note : Pour la fabrication de protéines et la fabrication d’ADN à grande échelle, nous cultivons les bactéries dans du liquide LB pur – “en suspension” avec agitation – mais lorsque nous avons besoin d’isoler des groupes spécifiques de bactéries qui sont toutes dérivées de la même “cellule mère” et donc génétiquement identiques, nous incorporons ce LB dans un gel afin que les différentes “colonies” génétiquement distinctes ne se mélangent pas, mais se développent en points gluants. Si vous voulez en savoir plus sur les différents milieux pour les trucs en suspension, consultez ce post http://bit.ly/bacterialmedia mais aujourd’hui je vais me concentrer sur la forme piégée dans le gel.
Nous ne donnons pas aux bactéries une cuisine 5 étoiles. Au contraire, nous voulons dépenser le moins d’argent possible tout en leur donnant les nutriments dont elles ont besoin. Au minimum, nous devons leur donner une source d’énergie, quelque chose qu’elles peuvent décomposer (cataboliser) pour fabriquer de l’ATP – ces choses peuvent être des sucres, des protéines, des graisses. En plus de décomposer les choses, ils doivent être capables de fabriquer des éléments comme les protéines et l’ADN (faire la partie anabolique du métabolisme). Cela nécessite des nutriments qui fournissent les éléments nécessaires comme le carbone et l’azote, ce qu’heureusement vous pouvez obtenir avec une recette simple et suffisante pour beaucoup de bactéries.
Il y a 3 composants principaux (même si 2 de ces composants ont eux-mêmes beaucoup de composants.
- TRYPTONE -> c’est un mélange de peptides formés par la digestion d’une protéine appelée caséine avec une enzyme pancréatique -> cela fournit des acides aminés que les bactéries peuvent utiliser pour fabriquer de nouvelles protéines
- EXTRAIT DE LEVURE -> cet “autolysat” de levure est fondamentalement juste tout ce qui se trouvait dans la levure (composés organiques, y compris les vitamines, les oligo-éléments, etc.) – et si c’était assez bon pour la levure…
- CHLORURE DE SODIUM (NaCl)(sel de table) -> permet l’équilibre osmotique, le transport, etc.
Les principales formulations de LB sont les versions “Miller”, “Lennox”, & “Luria” & elles diffèrent par la quantité de sel qu’elles contiennent. Miller & Bertani noie les bactéries dans du NaCl (10g/L) alors que Lennox utilise juste 5g/L et Luria juste 0,5g/L -> de telles recettes à faible teneur en sel sont bonnes si vous utilisez un antibiotique sensible au sel. dans l’article original, Bertani a également ajouté du glucose, mais la plupart des recettes ultérieures le laissent de côté.
Et en parlant d’omettre des choses, nous devons nous assurer de “laisser de côté” les bactéries que nous ne voulons pas, ce que nous pouvons faire en “sélectionnant” les bactéries que nous voulons en utilisant des milieux de sélection, qui contiennent des choses comme des antibiotiques, etc. qui suppriment la croissance des choses que vous ne voulez pas. Par exemple, lorsque nous introduisons des gènes dans des bactéries, nous le faisons normalement sous la forme de morceaux d’ADN circulaires appelés plasmides. Nous concevons ces plasmides pour qu’ils possèdent également un gène de résistance aux antibiotiques, de sorte que nous puissions ajouter cet antibiotique à l’aliment et qu’il puisse continuer à se développer, mais que d’autres choses ne puissent pas le faire http://bit.ly/2tcW4ky
Il existe également des milieux différentiels – cela permet le “dépistage” par opposition à la “sélection” – vous n’empêchez pas les choses de se développer, mais vous changez leur apparence – par exemple, nous utilisons le X-gal pour le criblage bleu-blanc http://bit.ly/2MxNPs2
Après avoir mis un plasmide avec mon gène dans des bactéries et obtenu des colonies, je choisis quelques-unes de ces colonies et je les mets dans du LB liquide (avec un antibiotique) pour les faire croître pendant la nuit afin de faire beaucoup de copies du plasmide, puis je peux purifier ces copies et les envoyer pour le séquençage afin de vérifier les fautes de frappe avant d’entrer dans la partie “préparation de l’expression”.
Quel que soit le milieu que vous utilisez, vous avez besoin qu’il soit stérile. Donc, vous l’autoclavez (le mettez dans un lave-vaisselle très chaud et à haute pression) -> assurez-vous que les bouteilles ne sont pas fermées hermétiquement ou elles exploseront (heureusement, je n’ai pas fait cette erreur) – et ne resserrez pas les couvercles avant que les bouteilles aient refroidi ou les couvercles se coinceront (j’ai *fait* cette erreur). Une autre erreur à ne pas commettre -> n’ajoutez pas les antibiotiques avant l’autoclavage, sinon vous les inactivez. En général, on ne les ajoute que juste avant d’être prêt à les utiliser.
En premier cycle, je faisais tous mes propres milieux, mais ici, nous en utilisons tellement, nous avons un technicien de laboratoire “faiseur de milieux” qui est incroyable et qui fait &stériliser nos milieux de croissance bactérienne. Vous savez que quelque chose est passé par un autoclave si les lignes sur son ruban autoclave sont noires – le ruban est sensible à la température donc il change de couleur quand il devient très chaud. J’ai vraiment envie de concevoir une ligne de ruban autoclave avec des blagues et/ou des messages anecdotiques – ainsi, si l’enseignement ne fonctionne pas, je suppose que j’ai une solution de secours !
plus sur les sujets mentionnés (&autres) #365JoursDeScience Tous (avec sujets listés) 👉 http://bit.ly/2OllAB0
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