Fixateurs à base de formaldéhyde

Informations sur le formaldéhyde à 37%

Il n’y a pas d’âge définitif après lequel le formaldéhyde à 37% n’est plus utile comme solution mère. La chimie du formaldéhyde est modérément complexe, mais après des discussions avec d’autres microscopistes, des fabricants et l’examen de textes pertinents, les observations suivantes sont applicables.

• Le formaldéhyde doit être conservé à température ambiante (les températures froides favorisent la formation de trioxyméthylène avec un précipité blanc qui en résulte)
• Le formaldéhyde doit être conservé de manière hermétique, car l’exposition à l’air favorise l’oxydation du formaldéhyde en acide formique (le formaldéhyde à 37% est généralement expédié avec 10-15% de méthanol pour inhiber ce changement).

Notre recommandation concernant les solutions mères à 37% : Si une solution de formaldéhyde à 37% est claire, incolore et ne présente pas de précipité, et qu’elle a été stockée à température ambiante dans une bouteille hermétiquement fermée qui n’a pas été exposée à la lumière du soleil, elle devrait être bonne, cependant, nous ne recommandons toujours pas d’utiliser une bouteille de stock qui a plus d’un an. Les bouteilles de formaldéhyde à 37 % déjà ouvertes ne doivent pas être utilisées plus de six mois. Par conséquent, nous recommandons aux laboratoires d’acheter leur formaldéhyde plus fréquemment et en plus petites quantités que ce qu’ils ont peut-être fait dans le passé.

L’utilisation de formaldéhyde à 37% n’est pas recommandée pour les fixateurs de microscopie électronique. Soit un formaldéhyde de qualité supérieure, sans méthanol, soit une solution fraîche faite à partir de paraformaldéhyde est un bien meilleur choix (voir les autres commentaires ci-dessous).

Informations sur le formol à 10%

Le fixateur formol tamponné à 10% est couramment utilisé pour préserver les tissus pour l’histologie de routine dans de nombreux laboratoires. Le formaldéhyde a plus de chance de s’oxyder dans cette concentration de fixateur de tissus et finalement la solution commencera à baisser en pH, malgré le tampon. Nous recommandons que les solutions de formol tamponnées à 10 % ne soient pas utilisées plus de 3 mois après leur mélange initial. La solution doit être claire, incolore, sans précipité et le pH ne doit pas être inférieur à 6,5.

L’autre problème du formol tamponné à 10% est la concentration lentement croissante de méthanol (un sous-produit indésirable du vieillissement du formaldéhyde). Le méthanol favorise l’agglutination des protéines, au lieu de la réticulation des protéines qu’effectue le formaldéhyde. Un fixateur sans méthanol donnera la meilleure conservation, en particulier si vous prévoyez d’utiliser le tissu pour la coloration d’anticorps à un moment ultérieur.

La façon la plus courante d’éviter le méthanol dans une solution de formaldéhyde est de fabriquer la solution à l’état frais à partir de paraformaldéhyde cristallin. Le paraformaldéhyde peut être assez dangereux à manipuler et il est souvent difficile de le faire passer en solution. Si votre laboratoire n’est pas un utilisateur régulier de fixateurs au formaldéhyde, il existe quelques options plus faciles que nous vous recommandons.

Une option consiste à acheter du formaldéhyde (aq) sans méthanol dans des ampoules scellées. Il suffit d’ajouter du PBS pour obtenir la concentration correcte de formaldéhyde et de l’utiliser immédiatement. Dix ampoules de 10 ml de formaldéhyde sans méthanol à 16 % coûtent environ 27 $.

L’autre option est d’acheter du formol tamponné neutre à 10 % (formaldéhyde à 4 %) dans un magasin de fournitures scientifiques, de l’utiliser pendant 3 à 6 mois, puis de le jeter (en tant que matière dangereuse). Cette solution contiendra un peu de méthanol (typiquement 1-2%), mais si elle est utilisée peu de temps après l’achat, cela ne devrait pas être significatif pour la plupart des utilisateurs. La solution tamponnée permet de ralentir le processus d’acidification. Une bouteille d’un litre coûte environ 20-25 $. Conservez le fixateur à température ambiante. Les lecteurs locaux de cette page doivent contacter le laboratoire du service d’histologie du CMM (626-4415) si vous avez des difficultés à trouver un fournisseur. (Veuillez noter que les différents fournisseurs utilisent des solutions tampons différentes. Pour une immunohistochimie et/ou une immunofluorescence cohérente, les utilisateurs doivent s’en tenir à un seul fournisseur).

Certains laboratoires ont posé la question de l’utilisation de formol à 10% non tamponné. A moins qu’il y ait une raison spécifique pour ce choix, nous ne le recommandons pas car ce fixateur devient rapidement acide. Le stockage des tissus dans ce fixateur au-delà de plusieurs heures doit être fortement déconseillé.

Recommandations pour une fixation optimale des spécimens

Les spécimens de tissus doivent être placés dans le fixateur aussi rapidement que cela est raisonnable après avoir été retirés d’un animal, le fixateur doit être au moins 20 fois le volume du tissu et le fixateur doit être changé après la première heure de fixation.

Le tissu doit être coupé de telle sorte que la dimension la plus fine ne dépasse pas 4-5mm d’épaisseur (la pénétration du formol est lente, environ 0,5mm/h). Cela correspond approximativement à l’épaisseur de deux quarts US. Si le tissu ou l’organe a une capsule épaisse (par exemple, un rein), les utilisateurs doivent savoir que la pénétration du fixateur ne sera pas aussi rapide à travers la capsule. Les échantillons trop épais peuvent se retrouver trop fixés à l’extérieur et mal fixés à l’intérieur, ce qui entraîne des problèmes d’interprétation dus à des artefacts de coloration.

La fixation initiale doit se faire à température ambiante car la pénétration du formol est liée à la température de la solution. Le formol doit être doucement agité avant utilisation pour éviter un gradient de concentration dans le flacon.

Le temps de fixation dépend quelque peu de l’épaisseur du tissu.

• Les monocouches de cellules cultivées n’ont pas besoin d’être fixées longtemps, généralement 15-30 min sont adéquates. Les cellules cultivées doivent passer de la fixation dans le protocole que le laboratoire de l’utilisateur utilise pour l’immunohistochimie/immunofluorescence.
• Les tissus et les organes doivent être fixés (selon leur taille) pendant 2 heures à un maximum de 24 heures. Ensuite, les tissus peuvent être conservés pendant de courtes périodes (de préférence pas plus de 3 jours) dans de l’éthanol (aq) à 70%. Un stockage plus long dans l’une ou l’autre solution peut entraîner un durcissement excessif des tissus et conduit à des difficultés de sectionnement des blocs de paraffine.

Suivre méticuleusement un protocole de fixation standardisé permet d’obtenir les résultats les plus cohérents.

Formol vs Formaldéhyde

Nous avons parfois rencontré une certaine confusion sur la différence entre le formaldéhyde et le formol. C’est un problème compréhensible, car les termes sont parfois utilisés de manière interchangeable. Il est incorrect d’utiliser les deux mots de cette façon. Les concentrations de fixateur chimique que les deux noms représentent sont très différentes.

Un fixateur étiqueté comme formol tamponné à 10 % n’est en fait qu’une solution de formaldéhyde à 4 %. Cela est dû au fait que le formol tamponné à 10 % est un exemple du jargon des histologistes d’autrefois décrivant une solution à 10 % faite à partir d’une bouteille de stock de 37 à 40 % de formaldéhyde (ou plus précisément : une solution de 3,7 à 4 % de formaldéhyde).

Sécurité du formaldéhyde

L’administration américaine de la sécurité et de la santé au travail (OSHA) est grandement préoccupée par le formaldéhyde. Si vous n’avez pas de fiche de données de sécurité (FDS) actuelle dans votre laboratoire pour le formaldéhyde, vous pouvez en trouver une dans les archives de FDS de SIRI.

Veuillez être conscient des dangers liés au formaldéhyde. La déclaration suivante provient d’une fiche de données de sécurité pour le formol tamponné à 10%:

“DANGER ! PEUT ETRE FATAL EN CAS D’INGESTION. NOCIF SI INHALÉ OU ABSORBÉ PAR LA PEAU. PROVOQUE UNE IRRITATION DE LA PEAU, DES YEUX ET DES VOIES RESPIRATOIRES. SENSIBILISANT FORT. PEUT PROVOQUER LA CÉCITÉ. LIQUIDE ET VAPEUR COMBUSTIBLES. RISQUE DE CANCER SUSPECTÉ. CONTIENT DU FORMALDÉHYDE QUI PEUT CAUSER LE CANCER. Le risque de cancer dépend de la durée et du niveau d’exposition.”

(pour les lecteurs locaux) Le département de gestion des risques de l’université d’Arizona propose un programme d’autoformation intitulé “Hazard Communication Training for Formaldehyde”. Ce guide vous permettra de vous familiariser avec tous les aspects pertinents de la norme OSHA de 1992 sur le formaldéhyde. Selon Risk Management, “une formation annuelle est requise pour les personnes utilisant des solutions de formaldéhyde supérieures à 0,1% ou des matériaux capables de libérer plus de 0,1 ppm de formaldéhyde.” Cela inclurait la plupart d’entre nous qui utilisent le formaldéhyde pour les fixateurs d’histologie ou de microscopie électronique.

Pour obtenir une copie du document “Hazard Communication Training for Formaldehyde”, veuillez contacter directement le Dept. of Risk Management and Safety (621-1570, University of Arizona faculty, staff and students only).

▲ top of page