Quando si tratta di far crescere colonie batteriche, LB-agar sale sul piatto – ma prima bisogna metterlo in uno stato di gel (una situazione a cui il suo amico agarosio può sicuramente riferirsi!) “-ose” è una desinenza che di solito si usa per indicare che qualcosa è uno zucchero – e l’agarosio è uno zucchero – ma anche l’agar! Quindi qual è la differenza? Sono correlati, ma differiscono per più di qualche lettera e queste differenze li rendono utili per fare matrici di gel per compiti diversi – gel di agarosio per separare i frammenti di DNA in base alle dimensioni e piastre di gel di agar per far crescere i batteri)
Un gar è una cosa simile a un pesce e AGAR (aka agar-agar (seriamente!)) è una miscela di 2 zuccheri – agaropectina & quello con cui siamo più familiari, agarosio. Quindi si ottiene l’agarosio purificando l’agar. E per capire perché si dovrebbe passare attraverso questo problema a volte, ma non altre volte, aiuta a sapere un po’ di più su cosa sono questi zuccheri.
L’agarosio è un polisaccaride (“poly” significa molti & zuccheri del saccaride, quindi un polisaccaride è una lunga catena di subunità di zucchero ripetute unite insieme). È un esempio di polimero. I polimeri sono lunghe catene di subunità ripetute. Polimeri diversi hanno subunità di tipo diverso (ad esempio, le subunità nucleotidiche si collegano per dare i polimeri che chiamiamo DNA o RNA; gli aminoacidi si uniscono per formare le proteine; e gli zuccheri monosaccaridi si concatenano per dare carboidrati complessi (come l’agarosio!))
Gli zuccheri hanno molti gruppi idrossilici (-OH) (a cui l’acqua si attacca felicemente, aiutandoti a formare un gel – una rete di polimeri “infinitamente” interconnessi (come 7° di Kevin bacon) contenente acqua. (altro a venire)). Le singole unità di zucchero (monosaccaridi) spesso adottano strutture ad anello (come nel caso dell’agarosio) in cui i gruppi -OH sporgono come gambe. Gli zuccheri possono avere lo stesso “legame” ma avere i gruppi collegati che sporgono in modi diversi & usiamo “L” e “D” per riferirci a quale direzione nello spazio puntano le gambe. Maggiori informazioni sulla stereochimica qui: bit.ly/2Q8Dnax
I monosaccaridi possono usare i loro -OH per collegarsi. Collegando 2 si ottiene un disaccaride. Aggiungete qualche altro e otterrete degli oligosaccaridi (oligo significa pochi). Collegare molti e si ottiene un polisaccaride (poly significa molti).
E parlando di molti, i multipli -OHs significano che ci sono più siti potenziali di collegamento (che specifichiamo con quale numero “indirizzi” sugli anelli di zucchero sono uniti). Si possono ottenere “ramificazioni”, ma nell’agarosio si hanno catene lineari (di circa 400 subunità). (Anche se le ramificazioni possono essere introdotte usando “reticolanti” per rafforzare l’agarosio in modo che possa fare cose come fare la cromatografia di esclusione delle dimensioni (“filtrazione del gel”) resina che può sopportare le alte pressioni generate in FPLC (Fast performance liquid chromatography).
Nell’agarosio, la subunità ripetente è un duo di zucchero (disaccaride) di galattosio (D-galattosio per essere precisi) legato a un monosaccaride galattosio modificato, 3,6-anidro-L-galattosio. Chiamiamo questo duo AGAROBIOSE (collegando un galattosio a un glucosio si ottiene il lattosio, un disaccaride che forse vi è più familiare).
Nel galattosio, gli anelli hanno 6 lati con 4 gambe -OH, 5 gambe -H, & 1 gamba metilidrossile (-CH₂OH). Spesso non disegniamo le gambe “-H” perché nascondono le gambe più interessanti che sono capaci di reagire. Nel galattosio modificato dell’agarosio, 2 dei gruppi -OH si sono legati & cacciando fuori un idrogeno (“anidro”) in modo che il braccio idrossile metilico sia collegato ad un braccio -OH formando un “ponte” sull’anello.
Circa 2/3 dell’agarosio è agarosio ma, l’agar contiene anche AGAROPECTINA. È molto simile (ha galattosi D & L alternati) MA molti di questi galattosi hanno modifiche. Ci sono diverse modifiche, tra cui l’aggiunta di solfato/i, acido piruvico, o gruppi metilici, o l’inserimento di una di quelle versioni a gambe collegate come nell’agarosio.
A differenza della natura ripetitiva coerente dell’AGAROSIO, è solo lo “scheletro” alternato D & L- del galattosio che è coerente nell’agaropectina. Le sue modifiche sono sparse in tutta la catena (per esempio, ~ogni 10° è attaccato a un solfato attraverso un legame -O-solfato, ma questo è solo in media, e non è probabile che siano distribuiti in modo preciso e uniforme). E, mentre le catene tendono ad essere più corte di quelle dell’agarosio, la loro lunghezza è anche variabile, quindi, l’agaropectina è davvero un bel mix & non si sa mai bene cosa si otterrà!
Il DNA ha un sacco di gruppi fosfato caricati negativamente (fosforo circondato da 4 ossigeni). Questo servirà come base per farli muovere attraverso il gel verso l’estremità positiva. Quindi abbiamo bisogno che il gel sia neutro.
Agar ha molti gruppi di solfato (zolfo circondato da ossigeni). Questi sono anche caricati negativamente, quindi possono interferire con il modo in cui il DNA si muove attraverso il gel. Quindi sarebbe una cattiva matrice per l’elettroforesi.
Ma l’agarosio è neutro, rendendo una buona matrice per l’elettroforesi.
Ma l’agarosio è anche più costoso perché deve essere purificato. Quindi, se non ci si deve preoccupare del problema della carica fisica, tanto vale usare qualcosa che ha una carica *monetaria* più bassa! Poiché l’agar richiede meno lavorazione, è più economico & perfetto per l’uso come matrice per contenere il cibo dei batteri!.
Nelle piastre di agar, non è l’agar stesso a fornire nutrienti. Questa è una delle grandi cose dell’agar – *la maggior parte* dei batteri non può mangiarlo. Invece, l’agar fornisce solo “impalcature” per ospitare i nutrienti di cui i batteri hanno bisogno. E spesso questi nutrienti sono forniti attraverso un “mezzo di crescita” liquido per batteri chiamato LB, che, indipendentemente da quello che dicono i vostri libri di testo, (almeno in origine) sta per Lysogeny Broth. A volte le iniziali di Luria, Lennox, o Luria & Bertani ottengono credito per il nome, ma in realtà sta per LYSOGENY BROTH e la sua ricetta fu pubblicata per la prima volta (da Giuseppe Bertani) nel 1951. Lo stava usando quando studiava la lisogenia (un processo in cui un virus che infetta i batteri, chiamato batteriofago (“phage”), inserisce il proprio DNA nel DNA di un batterio & aspetta il momento giusto per entrare nel fago litico dove si taglia da solo, fa un sacco di copie e fa esplodere la cellula) http://bit.ly/2HLuB1S
Lo scopo della LB è fondamentalmente quello di dare ai batteri ciò di cui hanno bisogno per crescere, dividersi e fare ciò che vogliamo (come fare copie del DNA che mettiamo in loro e/o fare copie di proteine usando le istruzioni del DNA che mettiamo in loro). E per farlo in modo economico.
Nota: Per la produzione di proteine e di DNA su larga scala, coltiviamo i batteri in un liquido LB puro – “in sospensione” con agitazione – ma quando abbiamo bisogno di isolare gruppi specifici di batteri che sono tutti derivati dalla stessa “cellula madre” e quindi geneticamente identici, incorporiamo quel LB in un gel in modo che diverse “colonie” geneticamente distinte non si mescolino, ma crescano invece come punti gommosi. Se vuoi saperne di più sui vari supporti per la sospensione guarda questo post http://bit.ly/bacterialmedia ma oggi mi concentrerò sulla forma intrappolata nel gel.
Non diamo ai batteri una cucina a 5 stelle. Invece, vogliamo spendere il meno possibile pur dando loro i nutrienti di cui hanno bisogno. Come minimo, dobbiamo dar loro una fonte di energia, qualcosa che possano scomporre (catabolizzare) per fare ATP – queste cose possono essere zuccheri, proteine, grassi. Oltre a scomporre le cose, devono essere in grado di fare cose come proteine e DNA (fare la parte anabolica del metabolismo). Questo richiede nutrienti che forniscano gli elementi necessari come il carbonio e l’azoto, che fortunatamente si possono ottenere con una ricetta semplice che è sufficiente per molti batteri.
Ci sono 3 componenti principali (anche se 2 di questi componenti hanno essi stessi un sacco di componenti.
- TRYPTONE -> questo è un mix di peptidi formato dalla digestione di una proteina chiamata caseina con l’enzima pancreatico -> questo fornisce aminoacidi che i batteri possono usare per fare nuove proteine
- ESTRATTO DI LIEVITO -> questo “autolisato” di lievito è fondamentalmente solo quello che è successo nel lievito (composti organici tra cui vitamine, microelementi, ecc.) – e se era abbastanza buono per il lievito…
- CLORURO DI SODIO (NaCl) (sale da cucina) -> permette l’equilibrio osmotico, il trasporto, ecc.
Alcune delle principali formulazioni di LB sono le versioni “Miller”, “Lennox”, & “Luria” & differiscono per la quantità di sale che hanno. Miller & Bertani annega i batteri in NaCl (10g/L) mentre Lennox usa solo 5g/L e Luria solo 0.5g/L -> tali ricette a basso contenuto di sale sono buone se stai usando un antibiotico sensibile al sale. nel documento originale, Bertani aggiungeva anche glucosio, ma la maggior parte delle ricette successive lo lascia fuori.
E parlando di lasciare fuori le cose, dobbiamo assicurarci di “lasciare fuori” i batteri che non vogliamo, cosa che possiamo fare “selezionando” i batteri che vogliamo usando mezzi di selezione, che contengono cose come antibiotici ecc. che sopprimono la crescita di cose che non vogliamo crescere. Per esempio, quando mettiamo i geni nei batteri, normalmente lo facciamo sotto forma di pezzi circolari di DNA chiamati plasmidi. Progettiamo quei plasmidi per avere anche un gene di resistenza agli antibiotici, in modo da poter aggiungere all’alimento quell’antibiotico ed esso può ancora crescere, ma altre cose non possono http://bit.ly/2tcW4ky
C’è anche un supporto differenziale – questo permette lo “screening” in contrapposizione alla “selezione” – non si impedisce alle cose di crescere, ma si cambia il loro aspetto – per esempio, usiamo X-gal per lo screening blu-bianco http://bit.ly/2MxNPs2
Dopo aver messo un plasmide con il mio gene nei batteri e ottenuto colonie, scelgo alcune di queste colonie e le metto in LB liquido (con antibiotico) per farle crescere durante la notte per fare molte copie del plasmide, poi posso purificare quelle copie e mandarle al sequenziamento per controllare gli errori di battitura prima di entrare nella parte di “preparazione dell’espressione”.
A prescindere dal mezzo che usi, hai bisogno che sia sterile. Quindi lo metti in autoclave (lo metti in una lavastoviglie molto calda e ad alta pressione) -> assicurati che le bottiglie non siano ben sigillate o esploderanno (per fortuna non ho fatto questo errore) – e non stringere nuovamente i coperchi fino a quando le bottiglie non si sono raffreddate o i coperchi rimarranno bloccati (ho *fatto* questo). Un altro errore da non fare -> non aggiungere antibiotici prima dell’autoclavaggio, o li inattiverai. Di solito non li aggiungiamo fino a poco prima di essere pronti ad usarli.
Nella laurea, ho fatto tutti i miei media, ma qui, ne usiamo così tanto, abbiamo un tecnico di laboratorio “media-maker” che è incredibile e fa & sterilizzare i nostri mezzi di crescita batterica. Sai che qualcosa è passato attraverso un’autoclave se le linee sul suo nastro autoclave sono nere – il nastro è sensibile alla temperatura, quindi cambia colore quando diventa molto caldo. Voglio davvero progettare una linea di nastro autoclave con messaggi scherzosi e/o banali – così se l’intera faccenda dell’insegnamento non funziona, credo di avere un backup!
più su argomenti menzionati (&altri) #365DaysOfScience Tutti (con argomenti elencati) 👉 http://bit.ly/2OllAB0
