Fissatori di formaldeide

Informazioni sulla formaldeide al 37%

Non esiste un’età definitiva dopo la quale la formaldeide al 37% non è più utile come soluzione stock. La chimica della formaldeide è moderatamente complessa, ma dopo discussioni con altri microscopisti, produttori e revisione dei testi pertinenti, le seguenti osservazioni sono applicabili.

• La formaldeide deve essere conservata a temperatura ambiente (le temperature fredde favoriscono la formazione di triossimetilene con conseguente precipitato bianco)
• La formaldeide deve essere conservata ben sigillata, poiché l’esposizione all’aria favorisce l’ossidazione della formaldeide in acido formico (la formaldeide al 37% viene solitamente spedita con il 10-15% di metanolo per inibire questo cambiamento).

La nostra raccomandazione riguardo alle soluzioni stock al 37%: Se una soluzione di formaldeide al 37% è chiara, incolore e non ha precipitato, ed è stata conservata a temperatura ambiente in una bottiglia ben chiusa che non è stata esposta alla luce del sole, dovrebbe essere buona, tuttavia, non raccomandiamo ancora di usare una bottiglia stock che è più vecchia di 1 anno. Le bottiglie di formaldeide al 37% che sono già aperte non dovrebbero essere utilizzate per più di sei mesi. Di conseguenza, raccomandiamo che i laboratori acquistino la loro formaldeide più frequentemente e in quantità minori di quanto forse abbiano fatto in passato.

L’uso della formaldeide al 37% non è raccomandato per i fissativi della microscopia elettronica. O una formaldeide di grado superiore, senza metanolo, o una soluzione fresca fatta di paraformaldeide è una scelta molto migliore (vedi ulteriori commenti sotto).

Informazioni sulla formalina al 10%

Il fissativo formalina tamponata al 10% è comunemente usato per conservare i tessuti per l’istologia di routine in molti laboratori. La formaldeide ha una maggiore possibilità di ossidazione in questa concentrazione di fissativo per tessuti e alla fine la soluzione inizierà a scendere di pH, nonostante il tampone. Raccomandiamo che le soluzioni di formalina tamponata al 10% siano usate non più di 3 mesi dopo essere state inizialmente miscelate. La soluzione dovrebbe essere chiara, incolore, senza precipitati e il pH non dovrebbe essere inferiore a 6,5.

L’altro problema con la formalina tamponata al 10% è la concentrazione lentamente crescente di metanolo (un sottoprodotto indesiderato della formaldeide di invecchiamento). Il metanolo promuove il raggruppamento delle proteine, invece della reticolazione delle proteine che fa la formaldeide. Un fissativo senza metanolo darà la migliore conservazione, in particolare se si prevede di utilizzare il tessuto per la colorazione degli anticorpi in un secondo momento.

Il modo più comune per evitare il metanolo in una soluzione di formaldeide è quello di fare la soluzione fresca da paraformaldeide cristallina. La paraformaldeide può essere abbastanza pericolosa da maneggiare ed è spesso difficile farla andare in soluzione. Se il tuo laboratorio non è un utente regolare di fissatori di formaldeide, ci sono un paio di opzioni più semplici che ti consigliamo.

Una opzione è quella di acquistare formaldeide senza metanolo (aq) in ampolle sigillate. Basta aggiungere PBS per ottenere la corretta concentrazione di formaldeide e usare immediatamente. Dieci fiale da 10 ml di formaldeide senza metanolo al 16% costano circa $27.

L’altra opzione è comprare formalina neutra tamponata al 10% (formaldeide al 4%) da un fornitore scientifico, usarla per 3-6 mesi e poi buttarla (come materiale pericoloso). Ci sarà un po’ di metanolo in questa soluzione (tipicamente 1-2%), ma se usato subito dopo l’acquisto questo non dovrebbe essere significativo per la maggior parte degli utenti. La soluzione tamponata aiuta a rallentare il processo di acidificazione. Una bottiglia da un litro costa circa 20-25 dollari. Conservare il fissativo a temperatura ambiente. I lettori locali di questa pagina dovrebbero contattare il CMM Histology Service Lab (626-4415) se avete problemi a trovare un fornitore. (Si prega di notare che diversi fornitori usano diverse soluzioni tampone. Per una coerente immunoistochimica e/o immunofluorescenza, gli utenti dovrebbero attenersi ad un solo fornitore).

Alcuni laboratori hanno chiesto di usare formalina al 10% non tamponata. A meno che non ci sia una ragione specifica per questa scelta, non la raccomandiamo poiché questo fissativo diventa rapidamente acido. La conservazione dei tessuti in questo fissativo oltre alcune ore dovrebbe essere fortemente sconsigliata.

Raccomandazioni per una fissazione ottimale dei campioni

I campioni di tessuto dovrebbero essere messi nel fissativo il più rapidamente possibile dopo essere stati rimossi da un animale, il fissativo dovrebbe essere almeno 20 volte il volume del tessuto e il fissativo dovrebbe essere cambiato dopo la prima ora di fissazione.

Il tessuto deve essere tagliato in modo che la dimensione più sottile non sia superiore a 4-5 mm di spessore (la penetrazione della formalina è lenta, circa 0,5 mm/ora). Questo è approssimativamente lo spessore di due quarti di dollaro. Se il tessuto o l’organo ha una capsula spessa (ad esempio un rene), gli utenti devono essere consapevoli che la penetrazione del fissativo non sarà così rapida attraverso la capsula. Campioni troppo spessi possono finire per essere sovra-fissati all’esterno e fissati male all’interno, il che causa problemi di interpretazione a causa di artefatti di colorazione.

La fissazione iniziale dovrebbe essere a temperatura ambiente poiché la penetrazione della formalina è legata alla temperatura della soluzione. La formalina dovrebbe essere agitata delicatamente prima dell’uso per evitare un gradiente di concentrazione nella bottiglia.

Il tempo di fissazione dipende in qualche modo dallo spessore del tessuto.

• I monostrati di cellule coltivate non hanno bisogno di essere fissati a lungo, in genere 15-30 min è adeguato. Le cellule coltivate dovrebbero passare dalla fissazione a qualsiasi protocollo che il laboratorio dell’utente sta usando per l’immunoistochimica/immunofluorescenza.
• I tessuti e gli organi dovrebbero essere fissati (a seconda delle loro dimensioni) da 2 ore a un massimo di 24 ore. In seguito i tessuti possono essere conservati per brevi periodi di tempo (preferibilmente non più di 3 giorni) in etanolo al 70% (aq). Una conservazione più lunga in entrambe le soluzioni può far sì che il tessuto diventi eccessivamente duro e porta a difficoltà nel sezionare i blocchi di paraffina.

Seguire meticolosamente un protocollo di fissazione standardizzato porterà ai risultati più coerenti.

Formalina vs Formaldeide

A volte abbiamo incontrato una certa confusione sulla differenza tra formaldeide e formalina. Questo è un problema comprensibile, dato che i termini sono talvolta usati in modo intercambiabile. Non è corretto usare le due parole in questo modo. Le concentrazioni di fissativo chimico che i due nomi rappresentano sono abbastanza diverse.

Un fissativo etichettato come formalina tamponata al 10% è in realtà solo una soluzione al 4% di formaldeide. Questo perché il 10% di formalina tamponata è un esempio del gergo degli istologi di una volta che descrive una soluzione al 10% fatta da un flacone di formaldeide al 37-40% (o più precisamente: una soluzione di formaldeide al 3,7-4%).

Sicurezza della formaldeide

La United States Occupational Safety and Health Administration (OSHA) è molto preoccupata della formaldeide. Se non hai una scheda di sicurezza del materiale (MSDS) attuale nel tuo laboratorio per la formaldeide, puoi trovarne una nel SIRI MSDS Archive.

Si prega di essere consapevoli dei pericoli connessi alla formaldeide. La seguente dichiarazione proviene da una scheda di sicurezza per la formalina tamponata al 10%:

“PERICOLO! PUÒ ESSERE FATALE SE INGERITO. DANNOSO SE INALATO O ASSORBITO ATTRAVERSO LA PELLE. PROVOCA IRRITAZIONE ALLA PELLE, AGLI OCCHI E ALLE VIE RESPIRATORIE. FORTE SENSIBILIZZATORE. PUÒ CAUSARE CECITÀ. LIQUIDO E VAPORE COMBUSTIBILI. SOSPETTO PERICOLO DI CANCRO. CONTIENE FORMALDEIDE CHE PUÒ CAUSARE IL CANCRO. Il rischio di cancro dipende dalla durata e dal livello di esposizione.”

(per i lettori locali) L’Università dell’Arizona Department of Risk Management ha un programma di auto studio chiamato “Hazard Communication Training for Formaldehyde”. Questa guida vi introdurrà a tutti gli aspetti rilevanti dello standard OSHA 1992 sulla formaldeide. Secondo Risk Management “la formazione annuale è richiesta per le persone che usano soluzioni di formaldeide superiori allo 0,1% o materiali capaci di rilasciare più di 0,1 ppm di formaldeide”. Questo includerebbe la maggior parte di noi che usano la formaldeide per istologia o fissatori per microscopia elettronica.

Per ottenere una copia dell’opuscolo “Hazard Communication Training for Formaldehyde”, si prega di contattare direttamente il Dipartimento di Risk Management and Safety (621-1570, solo facoltà, personale e studenti dell’Università dell’Arizona).

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