顕微鏡検査は真菌学の多くの側面で不可欠である。
- 臨床検体から真菌を直接検出する – 特定の感染症、たとえば接合菌感染症や脳脊髄液中のインディアインクに非常に特徴的な外観を示すことがある。
- アスペルギルスなどの空気感染する真菌を培養して、感染の原因であることを確認し、汚染物質である可能性は低い。
- 形態的外観から、真菌を同定することができる。
以下のセクションはかなり専門的かつ特殊で、検出率や報告スキルを向上させたい検査員向けに書かれています。
この表は、直接顕微鏡検査に使用する主なサンプルの種類と所見を示しています。
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Sample |
Fungi detectable and appearance |
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CSF |
India Ink preparation.Sample(サンプル)。 |
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Hair, nails and skin scraings |
Hyphae of dermatophyte or other filamentous fungi Yeasts of Candida |
Different fungi not distinguishable. |
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副鼻腔粘液 |
粘液で検出できる菌体は好酸球性真菌性副鼻腔炎の診断になる |
粘液は固定し病理組織切片として染色する必要がある |
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耳かき |
Hyphae, usually with sporulating head typical of Aspergillus niger. |
時折カンジダやイースト細胞が混じることがあります。 |
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角膜炎の角膜擦過 |
酵母や糸状菌が見られることがある |
菌性角膜炎の初期症状として有用である。 は原因菌種を区別しない |
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組織吸引または生検 |
糸状菌 カンジダの酵母または他の酵母のハイファを使用。 C. immitisの球状体 |
C. glabrataを示唆する菌糸のない小さな酵母や接合菌の非隔壁菌糸など非常に特徴のある真菌もあります。 |
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呼吸液 |
Yeasts of no significance Hyphae (without yeasts) consistent with disease Pneumocystis jirovecii |
Hyphae usually septate and typical of Aspergillus.DIA |
Pneumocystis jirovecii.DIA |
Yye! しかし、隔壁がない場合は、接合菌症または粘菌症を考慮する。 Imuunofluorescence superior for P. jirovecii |
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Blood film or bone marrow |
Histoplasma or rarely Penicillium |
A feature of disseminated histoplasmosis and found in 40%.[ヒストリフトパズマ症に典型的にみられる細胞内酵母の一種。 |
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腹膜液 |
酵母またはまれに菌糸 |
カンジダの確認に有用。 腹膜炎 |
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腟スワブ/スミア |
Candida albicans（イーストおよびヒフ）またはCandida glabrata |
Key 診断テスト |
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菌糸粒 |
特徴を持った菌糸が見られる場合がある |
通常、種に関して確定的ではない |
染色法
顕微鏡検査用の最も古い特殊製剤は濃厚（10～）なものである。20％）水酸化カリウム溶液。 ケラチンを軟化させ、真菌を直接視覚化し、いくつかの形態学的評価を可能にする。 グラム染色は感度が低い。 パパニコロウ染色が有用である。 細胞診スライドは、スライバー染色やゴモリメテナミン銀（GMS）染色で染色することができる。 ニューモシスチスの検出には、免疫蛍光顕微鏡検査が最も適している。 蛍光増白剤（Calcofluor white、Blankophor、Tinopal UNPA-GX）は真菌の細胞壁のキチン質に結合し、真菌の菌糸をスキャンする迅速な手段であり、形態学的評価を強化する。
特定疾患における顕微鏡診断の役割
CSFと髄膜炎
カプセル化したCryptococcus細胞は、しばしばCSFや他の宿主液または分泌物の標本に墨汁でマウントして検出することが可能である。 HIV陰性の約50％，HIV陽性の80％以上が髄液の墨汁検査で陽性となる。 しかし、特に無傷のリンパ球は、本菌と混同されることがある。 AIDS患者では、クリプトコッカス細胞は通常髄液中に多く存在するが、莢膜が小さいため識別が困難である。 治療中の患者における持続的なCSF陽性所見は、患者の臨床状態の悪化または培養陽性によって確認された場合にのみ、失敗または再発の証拠とみなされるべきです。
C. neoformansに典型的な、大きな莢膜と小さな娘細胞への細い芽を持つ複数の酵母を示すCSFの墨汁調製物
AIDS患者のCSFで見られるC. neoformans細胞の透過電子顕微鏡写真で、非常に少ない莢膜が存在します。
髄膜炎患者の髄液中の糸状菌で、その後の培養でCandida albicansが増殖した。
Hair
頭皮からの標本には毛根、詰まった毛包の中身、皮膚の鱗屑が必要だ。 favusを除き、感染した毛髪の遠位部にはほとんど菌が存在しない。 このため、毛根のない切毛は菌類学的調査には適さない。
感染物を直接顕微鏡で観察すると、罹患毛の外側（外毛根）または内側（内毛根）に皮膚糸状菌の節理菌が存在することがわかる。 節足動物は小さいもの（直径2〜4um）と大きいもの（直径10umまで）がある。 皮膚の鱗屑は菌糸と節足動物を含む。 T. schoenleinii感染症（favus）では、罹患した毛の中に節足動物の緩い鎖と空隙が見られる。
皮膚擦過傷では、白斑を伴う糸状菌糸が見られる。
Nails
顕微鏡検査や培養の成否は、採取した標本の質が大きな要因になる。 爪下の検体を採取する際に、時々わずかな不快感があることを除けば、検体を採取する際に痛みはないはずである。 下図は爪の標本を採取するのに適した部位を示している。
鈍いメスで採取したスクレイピングやクリッピングは、できればペーパークリップで留めて、折りたたんだ四角い紙に挟んで運ぶのが望ましいが、市販の菌学パックを利用することも可能である。 実験室では、試料の一部に20〜30％の水酸化カリウム溶液を加えて爪の角質をふやかし、直接顕微鏡で真菌の成分を調べることができるようにする。 または、各試料の一部を蛍光色素を含む爪溶解液に浸して検査する。 反応液の一例として、このようなものがある。 1gのNa2Sを7.5mlの蒸留水に溶解し、その後2.5mlのエタノールを加えて調製されたものである。 その後、10mlのBlankophorまたは20mlのTinopal UNPA-GX（蛍光増白剤28、F3543；Sigma）の1％水溶液を、この混合物に加える。
副鼻腔粘液
アレルギー性真菌性鼻副鼻腔炎（AFRS）の診断上の特徴は、患者の鼻または副鼻腔から採取した好酸性ムチン含有菌糸の存在で、菌による組織侵入を認めないことである。 菌糸は副鼻腔内ではまばらで、現在使用されている染色液で可視化するにはかなりの時間がかかる。 このような場合、アレルギー性鼻副鼻腔炎（ARS）や好酸球性ムチン性鼻副鼻腔炎（EMRS）など、他の診断が下されるのが通常である。 しかし、キチン染色や特異的抗アルテルナリア免疫蛍光染色など、より感度の高い診断技術の使用により、感度が向上する可能性がある。
耳管および外耳道炎
耳管から屑と分泌物を採取する必要がある。 直接顕微鏡で観察すると、枝分かれした菌糸、出芽した酵母細胞、あるいはその両方が確認できる。 アスペルギルス感染の場合、典型的な胞子頭が見られることもある。
角膜炎に対する角膜擦過
真菌性角膜炎は医学的緊急事態であり、速やかに認識し治療する必要がある。 微生物学的診断のためには、角膜の患部から採取したものが最適である。角膜上皮が無傷で、感染が角膜間質に限られている場合には、潰瘍部からの掻爬や生検という形で採取することがある。 角膜掻爬は、白金ヘラ、Beaver刃、Bard ParkerナイフNo.15、鈍器白内障ナイフなどの器具を使用して行う。 綿棒では壊死した角膜層の剥離に効果がない。 角膜の潰瘍部分の基部と縁から、繰り返し材料を採取すること。 材料が滅菌培地上に散布された場合は、同じ刃またはスパチュラを再度使用して追加の材料を採取することができるが、材料が非滅菌の顕微鏡スライドに接触した場合は、刃を交換する必要があり、スパチュラは炎で冷やし、その後再使用することができる。 糸状菌の分離したヒアルロン酸の菌糸は、Aspergillus、FusariumまたはAcremoniumの種を表している可能性がある。 Curvulariaなどの褐色糸状菌の着色した隔壁菌糸が見られることもある。 時には、Candida属が角膜炎の原因であるため、酵母や菌糸が見られることがあり、この診断が示唆される。
a
b
a. Lactophenol cotton blueで角膜を削ると、Fusarium sppやAspergillus sppの菌糸が分離する。 Philip Thomas博士、Tiruchirappalli ( a &b )
b. ラクトフェノール・コットンブルーで染色した別の角膜擦過痕は、Fusarium spp.にもAspergillus spp.にも典型的ではないビーズ状の隔壁を持つ菌糸を示す。 組織・腹膜液
組織切片や通常無菌の体液中に、カンジダ属の典型的な出芽酵母細胞、偽菌糸、真菌糸が顕微鏡的に検出されれば、侵襲性カンジダ症であることがわかる。 一般にC. glabrataは酵母細胞のみを産生し、C. albicansのみが真の菌糸を組織中に産生する
C. glabrataを含む遠心分離液（この場合は尿）のグラム染色は、C. albicansの菌糸を含む遠心分離液のグラム染色は、C. glabrataの菌糸を含む遠心分離液（この場合は尿）のグラム染色はC.
呼吸器検体
喀痰検査は、好酸球やシャルコーライデン結晶とともに菌糸が見られることが多いので、ABPAでは有用である。 また、ブラストマイセス・デルマティディスのような球状や大型の酵母を顕微鏡で観察すると、珍しい真菌症が診断されることがある。 真菌性気管支炎の気管支洗浄液には、アスペルギルスなどの糸状菌糸が見られることがあり、胞子状頭部が見えることもある。 BAL検体からの侵襲性肺アスペルギルス症では、使用する方法にもよるが、顕微鏡検査の方が培養よりも高い収率を示す施設もある。
KOHを用いた光学顕微鏡による粘膜栓の観察では、アスペルギルスに典型的なヒアルロン酸枝状菌糸のネットワークが認められる（ABPA患者）。
同じくBAL標本で、左はBlankophor、右はKOHで染色し、アスペルギルスに一致するヒアルロン酸の分生糸を示したもの。
呼吸液のKOH標本で、接合菌に典型的な広い非隔壁の菌糸を示す。
Blood film or bone marrow
血液と骨髄からの顕微鏡検査の感度は、通常AIDSにみられる播種性ヒストプラスマ症とペニシリウム・マーネフェイを除き、ほとんどの真菌感染症では標本を調べる時間が必要なくなるほど高くはない。
菌核腫の粒
菌核腫の診断は、できれば滅菌針を用いて破裂していない膿疱（洞）から採取した粒を確認することによって行われる。 病巣を持ち上げ、粒を含む副鼻腔内容物を絞り出し、スライドグラスに載せる。 粒を摘み取り、70％アルコールですすぎ、滅菌生理食塩水で洗浄した後、培養を行います。 20％水酸化カリウムで粒を直接顕微鏡で観察すると、菌核病の診断が確定し、原因菌が真菌か放線菌かも明らかになる。 黒色の粒は真菌の感染を示唆し、微小な白色の粒はノカルジア菌の感染を示唆することが多く、ピンヘッド大の大きな白色の粒は真菌由来か放線菌由来かのどちらかであろう。 赤色の小粒はActinomadura pelletieriに特異的であるが、黄白色の粒は放線菌由来または真菌由来の可能性がある。 放線菌の粒には直径1um以下の細い糸状菌が含まれるが，真菌の粒には直径2〜4umの短い絡み合った菌糸の塊が含まれ，色素を持つこともある。
Denning DW, Evans EGV, Kibbler CC, Richardson MD, Roberts MM, Rogers TR, Warnock DW, Warren RE. 真菌性爪疾患：良い診療のためのガイド（英国医真菌学会のワーキンググループの報告書）。 Dermatologica. 1989;179(4):183-6. PMID: 2695355
Procop GW, Haddad S, Quinn J, Wilson ML, Henshaw NG, Reller LB, Artymyshyn RL, Katanik MT, Weinstein MP.（英語）: 「皮膚科における直接真菌学的検査：さまざまな方法の比較」。 4種類の染色法による呼吸器検体中のPneumocystis jiroveciの検出。 J Clin Microbiol. 2004 Jul;42(7):3333-5. PubMed PMID: 15243109; PubMed Central PMCID: PMC446244.
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