1.4.3.2 Mosquitos
Los mosquitos son vectores de graves enfermedades humanas como la malaria, el dengue y la fiebre amarilla, y a pesar de los esfuerzos por controlarlos, siguen siendo un grave problema. Se espera que la identificación de nuevos genes de mosquitos implicados en la olfacción, la alimentación sanguínea, la digestión, la reproducción, la inmunidad, etc., proporcione las bases para el desarrollo de nuevos métodos para controlar las poblaciones de mosquitos y las enfermedades transmitidas por ellos (Chen et al., 2008).
La reciente información de la secuencia del genoma de tres de los principales mosquitos vectores, Anopheles gambiae, Aedes aegypti y Culex pipiens quinquefasciatus (http://www.vectorbase.org/), se ha utilizado para estudios de genómica comparativa y perfiles transcripcionales que están permitiendo la identificación de grandes conjuntos de nuevos genes de mosquitos. El ARNi se ha convertido rápidamente en la herramienta de elección para caracterizar la función de los genes en diversos campos de la biología de los mosquitos y las interacciones entre mosquitos y patógenos (por ejemplo, Fragkoudis et al., 2009). Esto ha dado lugar a la publicación de numerosos ensayos funcionales de ARNi en este grupo de organismos, incluyendo miembros de los aedines (A. aegypti, Armigeres subalbtus y C. pipiens) y anofelinos (A. gambiae y Anopheles stephensi). Sin embargo, la mayoría de estos estudios se han centrado en sólo dos especies: el principal vector del dengue y la fiebre amarilla, A. aegypti, y el vector africano de la malaria, A. gambiae (Tabla 1.1).
En esos estudios, la estrategia experimental típica implicaba la microinyección de dsRNA en el tórax de los mosquitos adultos, seguida de la alimentación, el desafío con patógenos, odorantes, insecticidas o condiciones de estrés, y el posterior examen de los mosquitos para analizar el efecto fenotípico del silenciamiento del gen objetivo en el proceso fisiológico estudiado, incluyendo el olfato, la alimentación, la digestión y el metabolismo, el estrés, la detoxificación, la formación de la cutícula, la reproducción, la inmunidad y la regulación de la diapausa. A continuación, presentamos algunos estudios representativos de RNAi en mosquitos.
La olfacción interviene en una amplia gama de comportamientos de los mosquitos, tanto adultos como larvas, incluyendo la alimentación, la preferencia por el huésped, la localización/selección de pareja y los lugares de cría para la oviposición. La olfacción implica la percepción de estímulos químicos proporcionados por moléculas odorantes y el desarrollo de respuestas específicas a dichos estímulos. Los odorantes son captados por proteínas de unión a odorantes (OBP), que los transportan a los receptores de odorantes (OR) en las membranas dendríticas de las neuronas olfativas. La reciente focalización de ARNi en los genes OBP y OR ha proporcionado información valiosa sobre su función en el mecanismo y la especificidad de la olfacción (Biessmann et al., 2010; Liu et al., 2010; Pelletier et al., 2010), lo que abre la oportunidad de modificar la percepción del olfato y, por tanto, una serie de comportamientos que podrían dar lugar a la prevención de la picadura y el apareamiento de los mosquitos.
En los climas templados, las hembras adultas de los mosquitos pasan el invierno en diapausa, un periodo de latencia que se caracteriza por la ausencia de comportamientos de búsqueda de hospedadores, la acumulación de enormes reservas de grasa y la detención del desarrollo ovárico. La manipulación de la regulación de este episodio de latencia podría dar lugar, por ejemplo, a la inducción de mosquitos latentes y no buscadores de huéspedes. Esto se ha ejemplificado en varios estudios del equipo del Dr. Denlinger. En particular, recientemente han utilizado el ARNi para investigar el mecanismo de la diapausa en C. pipiens, para evidenciar la participación de la vía de señalización insulina/FOXO en la regulación de la diapausa (Sim y Denlinger, 2008, 2009a). También tienen pruebas de la participación de algunas sintasas de ácidos grasos en la acumulación de reservas de grasa en las hembras que pasan el invierno (Sim y Denlinger, 2009b), y del papel de las proteínas ribosomales S3 y S2 en el desarrollo de los folículos en las hembras que no están en diapausa (Kim y Denlinger, 2010; Kim et al., 2010).
La vitelogénesis y la reproducción también se han caracterizado mediante RNAi en los mosquitos. Al igual que en el caso de las garrapatas, los mosquitos anautogénicos requieren la ingesta de sangre de un hospedador vertebrado para iniciar un ciclo reproductivo que incluya la producción de huevos. Los aminoácidos (AA) derivados de la harina de sangre son utilizados por el cuerpo graso del mosquito para sintetizar los precursores de la proteína vitelina, principalmente la vitelogenina (Vg), en un proceso denominado vitelogénesis. A continuación, la Vg se libera en la hemolinfa y es captada por los ovarios y depositada en los ovocitos en desarrollo a través de un VgR específico.
En el mosquito A. aegypti, la expresión del gen Vg ha sido estudiada intensamente por el equipo del Dr. Raikhel en una larga serie de elegantes experimentos, en los que utilizaron el RNAi como herramienta de genómica funcional inversa. Este equipo demostró que la transcripción del gen Vg está estrechamente regulada por las entradas combinadas de varias moléculas, incluyendo la cascada de la hormona esteroidea 20-hidroxidisona (20E) y la señalización nutricional AA/Target-of-Rapamycin (TOR). Esta serina/treonina quinasa es responsable de la transducción de la señal de AA, activando la fosforilación de la quinasa S6 que se requiere para la activación de los eventos traslacionales (Park et al., 2006; Roy y Raikhel, 2011). Además, mediante la inyección de un antagomir específico, el mismo equipo ha producido una depleción mediada por RNAi del miRNAi miR-27 para demostrar la función de miR-27 como regulador positivo tanto en la digestión de la sangre como en el desarrollo del huevo. De hecho, miR-27 por sí mismo está regulado por las vías 20E y AA/TOR (Bryant et al., 2010).
El sistema inmunitario innato de los mosquitos vectores comprende tres categorías funcionales de genes implicados en el reconocimiento de patógenos, las vías de señalización que median en la amplificación, modulación y transducción de señales y los mecanismos efectores que median en la eliminación de patógenos del huésped (Baton et al., 2008). El ARNi es en sí mismo un importante mecanismo inmunitario antiviral en los mosquitos. En la inmunidad antiviral basada en el ARN, el dsRNA viral es reconocido y procesado en siRNAs por el Dicer del mosquito. Después, estos ARNsi derivados del virus guían la inmunidad antiviral específica a través del ARNi y de los mecanismos efectores de silenciamiento del ARN relacionados (Ding, 2010). Numerosos trabajos informan sobre el uso del ARNi para caracterizar la función de los genes inmunitarios de los mosquitos. Los estudios sobre los mecanismos inmunitarios generales y los efectores se han centrado en los receptores de reconocimiento de patrones, las moléculas de la vía de señalización antibacteriana y antifúngica y las proteínas implicadas en otros mecanismos efectores celulares (revisado en Dong et al., 2006; Moita et al., 2005; Shin et al., 2003, 2006; Wang et al., 2006).
El ARNi también se ha utilizado en la caracterización de la interfaz entre el mosquito y el patógeno, y muchas investigaciones se centran en las moléculas del mosquito relacionadas con la inmunidad. Las interacciones moleculares en la interfaz mosquito-patógeno aseguran la supervivencia y el desarrollo tanto del patógeno como del vector. Por lo tanto, entender las interacciones moleculares entre los patógenos y sus mosquitos vectores es fundamental para el desarrollo de nuevas medidas de control. En la última década, se ha desplegado un intenso esfuerzo de investigación hacia la identificación y caracterización funcional de los genes de los mosquitos implicados en las respuestas inmunes inducidas por los patógenos, utilizando una variedad de enfoques que incluyen la genómica comparativa, el perfil transcripcional y el análisis funcional basado en RNAi (Baton et al., 2008). Estos esfuerzos se han centrado principalmente en dos asociaciones mosquito-patógeno, A. gambiae-Plasmodium sp. y A. aegypti-virus del dengue 2 (DENV-2). Las respuestas inmunitarias innatas de los mosquitos a la infección por arbovirus han sido revisadas en detalle por Fragkoudis et al. (2009), y las de los parásitos de la malaria han sido revisadas recientemente por Brown y Catteruccia (2006) y Baton et al. (2008), incluyendo enfoques de ARNi.
La mayoría de estos estudios basados en ARNi se han centrado en los genes de los mecanismos de defensa inmunitaria del mosquito más que en los genes que necesitan los patógenos para desarrollarse en el mosquito vector. En cuanto a los genes antimaláricos del mosquito sometidos a RNAi knock-down, la mayoría de ellos son los implicados en la matanza de ookinetes y en la melanización durante la penetración del intestino medio (revisado en Brown y Catteruccia, 2006; Baton et al., 2008). Con respecto a los genes antivirales del mosquito sometidos a knock-down, algunos son componentes de vías de señalización, mientras que otros forman parte de la defensa antiviral basada en RNAi (revisado en Fragkoudis et al., 2009).
Entre los trabajos más recientes, Guo et al. (2010) presentan un enfoque útil para identificar nuevas proteínas de A. aegypti que interactúan con el DENV-2. Estos autores desarrollaron el primer borrador de la red de interacción de proteínas del mosquito utilizando un enfoque computacional e identificaron 714 proteínas putativas de A. aegypti asociadas al DENV que se agrupan en cuatro categorías funcionales principales (replicación/transcripción/traducción, inmunidad, transporte y metabolismo). Diez de estas proteínas putativas asociadas al DENV fueron seleccionadas al azar para su validación mediante el silenciamiento génico mediado por RNAi, y el título viral del dengue en el intestino medio del mosquito se redujo significativamente para cinco de ellas.
En conjunto, estos resultados apoyan la idea de que la RNAi podría ser una poderosa herramienta para la caracterización de alto rendimiento del sistema inmune de los insectos vectores de enfermedades, contribuyendo así a la identificación y caracterización de posibles objetivos de los mosquitos para el desarrollo de nuevos métodos para controlar las poblaciones de mosquitos, los parásitos dentro de los mosquitos y las enfermedades transmitidas por ellos.
Tras el descubrimiento de que el ARNi es una de las principales defensas del mosquito contra los arbovirus, se ha informado de que la supresión de esta vía aumenta la carga viral en los mosquitos infectados (Sánchez-Vargas et al., 2009). Cirimotich et al. (2009) utilizaron un virus Sindbis diseñado para expresar una proteína que se une al dsRNA y presumiblemente lo protege del procesamiento en la vía del RNAi, actuando así como un supresor del RNAi. Este virus modificado produce muchas más partículas de virus de lo normal en los mosquitos infectados y es letal para una serie de especies de mosquitos (A. aegypti, Aedes albopictus, C. trithaeniorhynchus). Este enfoque es un ejemplo de un nuevo desarrollo basado en la genética, potencialmente útil en las estrategias de “supresión de poblaciones” para el control de mosquitos (Alphey, 2009).
También se ha desarrollado el objetivo opuesto, es decir, el refuerzo artificial de la inmunidad antiviral de los mosquitos basada en el ARNi para obtener mosquitos resistentes al virus. Se ha utilizado el ARNi antiviral para conferir resistencia al DENV en mosquitos A. aegypti transgénicos, mediante la expresión de una horquilla de ARN correspondiente a un fragmento del virus (Franz et al., 2009). Mediante el uso de promotores específicos de tejido y tiempo, la expresión del ARN de horquilla puede limitarse al intestino medio -las primeras células en ser infectadas- y sólo después de la comida de sangre, minimizando los problemas potenciales para la aptitud del mosquito derivados de la expresión constitutiva de un ARN de horquilla largo. En Alphey (2009) se analizan las ventajas y los problemas de utilizar este tipo de cepas transgénicas de mosquitos resistentes en estrategias de “sustitución de poblaciones” para el control de mosquitos.