Ontwerp en bereiding van shRNA plasmiden

Om de vraag te beantwoorden hoe shRNA volgorde correleert met knockdown werkzaamheid, werden 27 shRNA vectoren van 11 verschillende genen ontworpen en gebouwd (tabel 1). Doelsequenties werden geselecteerd in de coderende regio van elk gen en werden ontworpen om in grote lijnen voldoen aan de seminale studies van sequentie-eigenschappen voor siRNA oligomeer werkzaamheid. Dienovereenkomstig, sequenties zijn laag in de runs en hebben een G / C-verhouding van ongeveer 50%. De shRNA’s werden ontworpen om sites die verstoken zijn van enkele nucleotide polymorfismen te richten, en komen overeen met alle splice varianten geamplificeerd door onze real-time PCR primer sets.

Aangezien siRNA’s kunnen off-target effecten hebben, is het belangrijk voor functionele assays om een specifieke mutant met een of meer base mismatch binnen het doel herkenning site als een controle te maken . Om tijd en kosten te besparen, hebben we een methode ontwikkeld voor het maken van wild-type en mutant shRNA vectoren tegelijk (gedetailleerd in Methodes en figuur 1). Gen knockdown resultaten voor vier wild-type/mutant shRNA paren zijn weergegeven in figuur 2. Deze resultaten tonen het nut van deze methode in het verstrekken van een punt mutant shRNA vector die kan dienen als een loss-of-function controle voor gen knockdown door wildtype shRNAs. Hoewel gedetailleerde protocollen zijn gepubliceerd voor de bouw van shRNA vectoren , dit is het eerste protocol voor de productie van wild-type en mutant vectoren tegelijk en moet de uitvoering van zeer gecontroleerde systeem voor shRNA.

Strategie voor nauwkeurige sequencing door haarspeld structuren

Verificatie van de volgorde van een shRNA haarspeld is essentieel omdat mismatch van zelfs een nucleotide binnen de doelsequentie kan knockdown (figuur 2 en .) Een probleem dat vaak wordt aangetroffen bij de bereiding van shRNA vectoren is dat velen moeilijk te sequentiëren als gevolg van de intrinsieke secundaire structuur van de hairpin. Een strategie die onlangs voorgesteld om dit probleem te overwinnen omvat engineering een restrictie site binnen de lus / steel regio van de haarspeld om fysiek scheiden van de omgekeerde herhalingen door spijsvertering, en vervolgens samen sequentie met behulp van sense en antisense primers. Echter, de mogelijkheid om sequentiebepaling van shRNA constructen te bereiken zonder wijziging van de stam / lus-sequentie zou een duidelijk voordeel zijn. Om deze mogelijkheid aan te pakken, evalueerden we gewijzigde sequencing reacties voor verbetering van de read-through van de haarspeld secundaire structuur in drie shRNA hairpins. Wijzigingen omvatten het toevoegen van middelen waarvan bekend is dat ze de DNA-structuur ontspannen, waaronder DMSO, betaïne, PCRx Enhancer en ThermoFidelase I; en het toevoegen van toenemende hoeveelheden dGTP BigDye terminator (dGTP) chemie aan de standaard BigDye v1.1 (BD) chemie die dITP bevat in plaats van dGTP.

Sequencing resultaten voor elk van de drie DNA-constructen zijn samengevat in tabel 2. Het doorlezen van de haarspeldstructuur werd gemeten als de verhouding van de piekhoogte ongeveer 300 basen na de haarspeldstructuur tot het signaal ongeveer 50 basen vóór de haarspeldstructuur. Een verhouding van 1 wijst op geen signaalverlies en 0 op volledig verlies van doorlezing. In afwezigheid van enig additief aan de BD-chemie veroorzaakte de haarspeld een vermindering van de piekhoogteverhouding voor onze minder strak gestructureerde haarspeld, pHSPG-shmutTLR4, tot 0,4, en een volledig verlies in doorlezen voor de andere twee plasmiden. Dit kan worden gevisualiseerd als een abrupte stop in de sequentie piek profiel voor pHSPG-shTLR4 (figuur 3A).

Onder de DNA-ontspanners, 5% DMSO, 0,83 M betaïne en 1 × PCRx Enhancer elk verbeterde de sequentie gelezen aanzienlijk voor sommige constructen. De toevoeging van 0,83 M betaïne plus 1 × PCRx Enhancer aan BD-chemie bleek echter de meest consistente sequentie te hebben, met piekhoogteverhoudingen van 0,5-0,9 (tabel 2 en figuur 3B). De toevoeging van 10:1 BD:dGTP chemie alleen verbeterde het doorlezen ook enigszins, met piekhoogteverhoudingen van 0,5-0,6 (tabel 2 en figuur 3C). De sub-optimale piekhoogte verhouding voor 10:1 BD:dGTP kan worden toegeschreven aan een zichtbare stap in de sequentie piek profiel na de secundaire structuur regio waar het signaal wordt verminderd (figuur 3C, pijl). Verhoging van de dGTP chemie inhoud tot 5:1 en 3:1 BD:dGTP of met behulp van rechte dGTP chemie verhoogde de piekhoogte verhouding en verminderde de stap enigszins (0,6 tot 0,8 verhouding). De gemengde incorporatie van dITP en dGTP resulteerde echter in een slechtere piekverbreding naarmate de hoeveelheid dGTP toenam, en alleen dGTP-chemie veroorzaakte ernstige sequentiecompressies (gegevens niet weergegeven). De beste algemene resultaten werden waargenomen door het combineren van betaïne plus PCRx en 10:1 BD: dGTP gemengde chemie samen. Deze combinatie verminderde de stap met minder piekverbreding en verhoogde de piekhoogteverhoudingen tot 0,9-1,0 (tabel 2 en figuur 3D). ThermoFidelase I, een DNA destabiliserend enzym dat vaak wordt gebruikt om de sequentiebepaling van genomisch DNA te verbeteren, verbeterde de sequentiebepaling van geen van de drie hairpins in rechte BD-chemie (gegevens niet weergegeven), en verminderde de piekhoogteverhouding aanzienlijk in 10:1 BD:dGTP chemie voor alle drie shRNA constructies, waardoor een stop in de haarspeldstructuur opnieuw verschijnt (tabel 2 en figuur 3E).

Samengevat, de combinatie van 10:1 BD:GTP chemie, 0,83 M betaïne, en 1 × PCRx Enhancer zorgde voor een optimale sequencing, en gemengd BD:dGTP chemie, betaïne, PCRx Enhancer, en DMSO hadden elk een aantal positieve effecten op hun eigen. ThermoFidelase I moet echter waarschijnlijk worden vermeden voor shRNA-vectoren met een moeilijke intrinsieke secundaire structuur.

Correlatie tussen shRNA knockdown-efficiëntie en gepubliceerde algoritmen voor siRNA-ontwerp

Om te bepalen of de werkzaamheid van knockdown door shRNA-vectoren correleert met gepubliceerde regels voor het ontwerp van effectieve siRNA-oligonucleotiden, werden shRNA’s geëvalueerd op hun vermogen om genexpressie knockdown te maken. De shRNA’s werden stabiel getransduceerd in THP1 of Jurkat menselijke cellijnen zoals beschreven in tabel 3, eerste twee kolommen. De gemiddelde knockdown werd bepaald aan de hand van RNA dat op drie of meer verschillende dagen was verzameld en wordt voor elke shRNA vermeld (kolom 3). Knockdown is reproduceerbaar gebleken voor cellijnen die onafhankelijk van elkaar zijn getransduceerd en gesorteerd, wat suggereert dat knockdown een functie is van de shRNA-doelsequentie en niet van kenmerken van de virale transductie. Meer dan een derde van de geconstrueerde shRNA-vectoren waren niet in staat de transcriptie te onderdrukken (<10% in kolom 3), ondanks vergelijkbare groeisnelheden en langdurige expressie van de GFP-marker op hoge niveaus in deze cellijnen. Bovendien grote variaties in knockdown werkzaamheid voor verschillende shRNAs gemaakt tegen veel van dezelfde genen (dat wil zeggen, CLR16.2, CLR19.3 en TLR4) pleiten tegen een eenvoudige biologische redenen voor verschillen in werkzaamheid voor deze genen. Veel van de ineffectieve shRNA’s hebben negatieve 5′ ΔΔG-waarden en een hoge Reynolds-score, waarvan wordt verondersteld dat ze correleren met de werkzaamheid van siRNA-knockdown (tabel 3, kolommen 4 en 5). Omgekeerd, onder de shRNA’s die in staat waren om gen knockdown te verlenen, hadden verschillende ofwel positieve 5’ΔΔG waarden of lage Reynolds scores. Deze bevindingen wijzen erop dat 5’ΔΔG en Reynolds scoring algoritme voor siRNA kan geen positieve correlatieve criteria voor shRNA design.

Om te bepalen of andere gepubliceerde algoritmen voor siRNA oligonucleotide ontwerp kan worden toegepast op shRNA vectoren, werd elk van de shRNA doelsites geëvalueerd door vier extra algoritmen, en de scores werden uitgezet tegen het percentage knockdown voor elke shRNA (tabel 3, kolommen 6-9 en Fig. 4). Voor elk algoritme plot een beste fit lijn werd getrokken en de R2 waarde berekend als een indicatie van de vraag of de variantie in knockdown werkzaamheid kan worden verklaard door het algoritme scoren. De resultaten bevestigen een slechte associatie tussen shRNA werkzaamheid en ofwel 5 ‘ΔΔG (vrije energie differentieel) overwegingen of de Reynolds et al. algoritme , en tonen ook een slechte associatie met de Hsieh et al. algoritme , met elk in feite vertonen een zwakke omgekeerde correlatie met de gegevens. De algoritmen van Amarguizoui et al. , Ui-Tei et al. , en Takasaki et al. , correleren direct met shRNA werkzaamheid. Echter, geen van de algoritme scores verklaren een significant percentage van de variantie in knockdown werkzaamheid. Van de geteste algoritmen vertoont het scoresysteem van Takasaki et al. de hoogste associatie, met een R2-waarde van 0,0251.

Omdat deze resultaten suggereren dat een lineaire relatie niet sterk van toepassing op shRNA knockdown voor een van de zes algoritmen, evalueerden we elk van de algoritmen door ROC curve analyse om te bepalen of een algoritme is superieur aan de anderen op het identificeren van effectieve shRNAs. De ROC curve is een plot van gevoeligheid (de ware positieve fractie, TPF) versus 1 minus de specificiteit (de vals-positieve fractie, FPF) die wordt gegenereerd door het variëren van de beslissingsdrempel tussen de minimale en maximale algoritme score. De diagonaal van de ROC-plot geeft de ROC-curve weer voor een algoritme dat niet beter discrimineert dan willekeurige selectie. Algoritmen die slecht discrimineren hebben ROC-curven die langs de diagonaal lopen en een gebied onder de ROC-curve (AUC) hebben dat niet significant verschilt van de AUC van de diagonaal (0,5). Algoritmen die goed discrimineren hebben ROC-curves met sterke convexe afwijking van de diagonaal en AUC’s die 1 benaderen en significant verschillen van de AUC van de diagonal.

Het algoritme van Hsieh et al. had een concave ROC-curve (Fig. 5A) die onaanvaardbare gevoeligheid en specificiteit aangeeft bij het discrimineren van effectieve van ineffectieve shRNA’s. De ROC curven voor alle andere algoritmen (Fig. 5B-F) volgden de diagonaal van de ROC plot en hadden AUCs die niet significant verschilden van de AUC van de diagonaal (Figs 5B-F). Dus, geen van de algoritmen toonde een statistisch significant vermogen om onderscheid te maken tussen effectieve en ineffectieve shRNAs.

Het Takasaki et al. algoritme (Fig. 5F) toonde de meeste belofte als een discriminator van effectieve van ineffectieve shRNAs. Echter, dit algoritme leed aan een relatief hoge vals-positieve fractie voor de beslissing drempels in de buurt van de maximale score, zoals aangegeven door de zwakke, grillige afwijking van de diagonaal in de buurt van de oorsprong van de ROC-curve (Fig. 5F). Dit gaf aan dat het algoritme een hoge score toegekend aan een aantal ineffectieve shRNAs. Inspectie van de gegevens bleek dat twee van de drie hoog scorende ineffectieve shRNAs gericht genen waarvan de expressie met succes werd neergehaald door andere shRNAs (tabel 3, asterisken). Het is dus onwaarschijnlijk dat de inefficiëntie van de shRNA’s een gevolg is van selectieve druk tegen de stabiele onderdrukking van genexpressie. Het is waarschijnlijker dat het algoritme van Takasaki et al. geen rekening houdt met een kritische eigenschap van effectieve shRNA’s.

Toepassing van een wijziging van het algoritme op basis van de stabiliteit van de 6 centrale basen van elke shRNA

Inspectie van de fysische eigenschappen van de hoog scorende ineffectieve shRNA’s bracht aan het licht dat de gemiddelde stabiliteit van de duplex gevormd door de 6 centrale basen van de shRNA’s (basen 6-11 van de sense streng gehybridiseerd aan basen 9-14 van de antisense streng) groter was dan de gemiddelde stabiliteit van hoog scorende effectieve shRNA’s (ΔG = -13.1 ± 0,1 versus -11,1 ± 1 kcal/mol respectievelijk). Op basis van deze waarneming werd het algoritme van Takasaki et al. zodanig gewijzigd dat aan shRNA’s met een centrale duplex ΔG gelijk aan of minder dan -12,9 kcal/mol een minimumscore werd toegekend (tabel 4). Door deze wijziging werden minimumscores toegekend aan vijf shRNA’s, waarvan er vier niet effectief waren, waardoor de specificiteit van het algoritme toenam zonder een significant verlies in gevoeligheid. Een minimum score toegekend aan een effectieve shRNA (71% knockdown), geeft aan dat andere eigenschappen in aanvulling op centrale duplex stabiliteit invloed werkzaamheid. Niettemin, de toevoeging van deze wijziging geëlimineerd de zwakke grillige afwijking van de ROC-curve van de diagonaal voor hoge beslissingsdrempels en verhoogde de AUC tot 0,79 (Fig. 5I). Een soortgelijke wijziging van de algoritmen van Amarzguioui et al. en Ui-Tei et al. verhoogde ook de AUC’s van hun ROC-curven (Fig. 5G en 5H). Met deze wijziging waren de AUC’s van de ROC-curven voor alle drie gewijzigde algoritmen significant verschillend van de AUC van de diagonaal (Fig. 5G-I), hetgeen wijst op een statistisch significant voorspellend vermogen. De verschillen tussen de AUC’s van de ROC-curven voor de gewijzigde algoritmen waren niet significant, dus op statistische gronden waren alle drie de gewijzigde algoritmen van gelijk nut. De 5′ ΔΔG, Reynolds et al, en de Hsieh et al al algoritmen werden niet statistisch significant beter door toepassing van de centrale duplex ΔG modificatie (gegevens niet weergegeven).

Om de mogelijkheid dat de verbetering bereikt door de wijziging van de Amarzguioui et al, Ui-Tei et al, en Takasaki et al. algoritmen is een gevolg van overfitting onze set van shRNA’s, een onafhankelijke set van 38 shRNA’s gepoold uit eerdere publicaties (; Tabel 5) werden onderworpen aan analyse. Terwijl geen van de ROC curven voor de drie ongewijzigde algoritmen had een AUC significant verschillend van die van de diagonaal (Amarzguioui et al., p = 0,174; Ui-Tei et al. p = 0,09; Takasaki et al., p = 0,26), alle van de gewijzigde algoritmen leverde ROC curven met AUCs significant verschillend van de AUC van de diagonaal (p = 0,0001-0,009; Figs. 5J-L). Op statistische gronden waren alle drie de gewijzigde algoritmen van even groot nut, aangezien de AUC’s van de ROC-curven voor de gewijzigde algoritmen alle drie significant verschilden van de AUC van de diagonaal, maar niet significant van elkaar. Deze analyse van een onafhankelijke reeks shRNA’s suggereert dat de wijziging van de algoritmen van algemene geldigheid is.

Omdat het minimaliseren van het vals-positieve percentage de eerste zorg is in het shRNA-ontwerp, raden wij aan het gewijzigde algoritme van Ui-Tei et al. algoritme, dat de laagste hoge vals-positieve fractie had bij beslissingsdrempels in de buurt van de maximale score, zoals aangegeven door de sterke afwijking van de diagonaal in de buurt van de oorsprong van de ROC-curve (Figs. 5H en 5K). Met behulp van een beslissingsdrempel van 3 beperkt de selectie van shRNAs tot een gebied van de ROC-curve waar de gevoeligheid was aanvaardbaar (0,28-.33), terwijl de specificiteit was zeer goed (1,0). Door het instellen van deze beslissingsdrempel, werd de vals-positieve fractie geminimaliseerd, terwijl 28 – 33% van de effectieve shRNA’s werden geïdentificeerd uit onze shRNA’s en de gepubliceerde set van shRNA’s respectievelijk. Mocht de gevoeligheid moeten worden verhoogd, raden wij aan een beslissingsdrempel van 2 te gebruiken. Deze drempel had een gevoeligheid van 0,54 – 0,55 en een specificiteit van 0,88 – 0,9. Indien de beslissingsdrempel verder werd versoepeld tot 0, steeg de sensitiviteit tot 0,86 – 0,9, maar daalde de specificiteit tot 0,55 – 0,54. Wij bevelen aan een zo hoog mogelijke beslissingsdrempel te gebruiken.

Hoewel statistisch gezien klein, heeft deze studie voor zover wij weten het voordeel dat het de grootste gepubliceerde reeks op 19-mer gebaseerde shRNA’s tot op heden is. Bovendien, in tegenstelling tot andere shRNA studies die noodzakelijkerwijs zijn scheef in de richting van effectieve shRNAs, onze studie omvat zowel functionele en niet-functionele shRNAs. We hebben aangetoond dat gemodificeerde Ui-Tei et al., Amarzguioui et al. en Takasaki et al. algoritmen zijn redelijk tot goed voorspellende tools die onderscheid maken effectieve van ineffectieve shRNAs. Er zijn echter nog belangrijke tekortkomingen in de gewijzigde algoritmen. Een directe beoordeling van de algoritmewijzigingen met behulp van shRNA’s die volgens elk oorspronkelijk en gewijzigd algoritme zijn ontworpen, zou deze bevindingen ondersteunen. Deze algoritmen zijn bedoeld om het aantal geselecteerde vals-positieve shRNA’s te verminderen, niet volledig te elimineren, en dit zou dus een groot aantal shRNA’s vereisen om een statistisch significant verschil in vals-positief percentage te verkrijgen. De beschikbaarheid van grotere shRNA data sets moeten ondersteunen de ontwikkeling van algoritmen met verbeterde gevoeligheid en specificiteit. Bovendien kunnen verschillende softwaretoepassingen voor het ontwerpen van siRNA-oligonucleotiden die in deze studie niet in aanmerking zijn genomen, van nut zijn bij het ontwerpen van shRNA’s. De criteria voor het ontwerpen van functionele siRNA-oligonucleotiden blijven controversieel, zoals blijkt uit het grote aantal studies dat nog steeds voor siRNA-ontwerp wordt opgezet, en aangezien wij deze sequenties niet als siRNA’s hebben getest, kan niet worden vastgesteld of de wijziging van deze algoritmen ook van toepassing is in het kader van siRNA-oligonucleotiden. shRNA heeft een extra complexiteitslaag ten opzichte van siRNA-oligonucleotiden, aangezien de haarspeld in de cel moet worden verwerkt alvorens het RISC-complex binnen te gaan. Bovendien zou selectieve druk tegen de stabiele expressie van shRNA’s die schadelijk zijn voor de celgroei naar verwachting een extra beperking op de stabiele expressie van bepaalde shRNA’s te verlenen. Ondanks deze complexiteit beginnen onze bevindingen inzicht te geven in de mogelijkheid om siRNA-algoritmen toe te passen voor het ontwerpen van functionele shRNA’s.