Celcyclus langs de maïswortel
Maïs primaire wortel werd verdeeld in opeenvolgende segmenten die de grenzen van de wortelkap, apicale meristeem elongatiezone en differentiatiezone aangaven, volgens eerdere resultaten (Alarcón et al., 2016). De afstand van de RCJ tot de wortel-apex werd geschat op 457 µm, die werd verwijderd alvorens de wortel in verschillende zones te verdelen. De wortelapicale meristematische zone (MZ) bevindt zich in de meest apicale 1,5 mm van de wortel vanaf RCJ en de overgangszone (TZ) liep door tot 3 mm. De snelle rekzone (EZ), waar de cellen snel rekten, werd toegewezen aan 3-6 mm; en in gebieden ver weg van 6 mm zagen we dat de celreksnelheid begint af te nemen, wat wijst op de zone die de groei beëindigt (Verbelen et al., 2006). Zones op 12-20 mm en 20-30 mm van RCJ zijn differentiatiezones (DF), waar zijwortels hun ontwikkeling beginnen. Gelijkaardige dissecties van wortels werden gemaakt in Arabidopsis, waar de wortel werd ontleed in vijf secties die korter zijn dan die in maïswortel (Cools et al., 2010). Onlangs is een differentiële genexpressie langs de Arabidopsis wortel gerapporteerd, en de onderdrukte of geïnduceerde genen variëren vooral in de verandering van de meristematische naar de overgangszones, evenals van de overgang naar de elongatiezone (Chaiwanon en Wang, 2015).
De limiet van wortelmeristeem wordt bepaald door de uitgang van de celcyclus en de balans tussen celdeling en celverlenging (Perilli et al., 2012). Het flowcytometrieprofiel toont de celcyclusprogressie langs de primaire wortel, en gegevens met het aantal relatieve cellen op de celcyclusfasen geven de celactiviteit in verschillende wortelzones aan. Wanneer cellen de celcyclus verlaten, zouden ze dus kunnen stoppen met fietsen. Bovendien wordt algemeen aangenomen dat celuittreding uit de celcyclus plaatsvindt na mitose, en de beslissing om een nieuwe celcyclus in te gaan wordt genomen op het G1-naar-S-overgangspunt in reactie op groeifactoren en verschillende hormonen (Gutierrez et al., 2002; Inzé en De Veylder, 2006; Polyn et al, 2015).
In Fig. 1 laten we zien dat, in wortels van 150-160 mm gekweekt bij 30°C, het meristeem praktisch beperkt is tot MZ, de zone 0-1,5 mm vanaf RCJ waar de percentages cellen in G0/G1-, S-, en G2/M-fasen respectievelijk ongeveer 27, 23 en 39 waren (Tabel 1). De relatieve duur voor G1, S, G2 en M in Allium meristeem is geschat op respectievelijk 26,5, 44,5, 16,5 en 12,5% (Giménez-Martín et al., 1977), en deze percentages zijn zeer vergelijkbaar in andere soorten. Hoewel onze resultaten meldden dat het meristeem van maïs een lager percentage cellen in de S-fase heeft, waren de waarden (23%) voldoende om te wijzen op progressie van de celcyclus (Reichheld et al., 1999). Deze relatieve verhoudingen veranderden buitengewoon wanneer TZ werd geanalyseerd, in deze zone. De percentages bedroegen respectievelijk 9, 10 en 68%, voor de G0/G1, S en G2/M fasen. Dit resultaat suggereert dat de cellen de celcyclus begonnen te verlaten wanneer ze op 1,5 mm van RCJ kwamen. Bovendien suggereerden de percentages in EZ dat bij 3 mm cellen uit de celcyclus zijn (Fig. 1, Tabel 1). Bovendien werd de daling van het percentage cellen in de G0-G1- en S-fasen gecompenseerd door een stijging in G2-M (tabel 1, fig. 2). Deze resultaten tonen duidelijk aan dat cellen de celcyclus stoppen wanneer ze in fase G2 zijn.
Distributie van de celpopulatie in de verschillende fasen van de celcyclus langs de wortel-apex. Wortels werden hydroponisch gekweekt bij 30°C tot ze 150-160 mm lang werden. De gegevens zijn afkomstig van een individueel representatief experiment waarbij minstens 10.000 cellen werden gebruikt voor de schatting van de percentages op verschillende afstanden tot de RCJ. De experimenten werden in drievoud uitgevoerd.
Tabel 1.
Effect van temperatuur op de celcyclus in de verschillende zones van de worteltop van maïs
Temperatuureffect op de celcyclus langs de apex van de maïswortel. Histogrammen met de frequentie van het DNA-gehalte van cellen uit verschillende segmenten van de maïswortelpunt, gekweekt bij 20°C en 30°C. De linker kolom geeft de histogrammen weer van wortels die bij 30°C zijn gegroeid; de rechter kolom is van wortels die bij 20°C zijn gegroeid. De wortels werden verdeeld in verschillende segmenten: 0-1,5 mm (A,G); 1,5-3 mm (B,H); 3-6 mm (C,I); 6-12 mm (D,J); 12-20 mm (E,K) en 20-30 mm (F,L). Gegevens zijn afkomstig van een individueel representatief experiment met ten minste 10.000 cellen. Experimenten werden uitgevoerd in drievoud.
Het is gemeld dat de meeste celtypen de meristeem verlaten in G1-fase, en de laatste tijd G1-naar-S overgang wordt alleen getriggerd in perycicle cellen om laterale wortel te initiëren (Vanneste et al., 2007). In de Arabidopsis pericyclus is voorgesteld dat cellen die grenzen aan de protoxilempolen de celcyclus zonder onderbreking doorlopen wanneer zij door de overgangsfase, de rekfase en de differentiatiezone gaan (Dubrovsky et al., 2008). Deze cellen zijn de enigen die zich delen om zijwortelprimordia te initiëren. De rest van de cellen die de wortel vormen, delen zich echter niet. De epidermale en cortex cellen, die het merendeel van het wortelweefsel uitmaken, blijven dus niet in cyclus wanneer ze de wortelmeristeem verlaten.
In onze analyse zagen we een opmerkelijke toename van cellen in fase G2 in TZ en EZ. Dit resultaat suggereert dat cellen die het meristeem in fase G2 verlaten, geen mitose ondergaan, maar dat ze in deze G2-fase stoppen en erin blijven. Wij speculeren dat cellen die het meristeem verlaten in de G1- of S-fase de celcyclus voortzetten tot G2, waar ze stoppen. Dit is gebaseerd op de waarneming dat de daling van het percentage cellen in G0/G1 tussen MZ en TZ (29,7%) wordt gecompenseerd door een stijging in G2 (28,8%) (Tabel 1, Fig. 2). Een zwakke daling in G2 percentage wordt bereikt tussen EZ en het basale einde van DZ (20-30 mm van RCJ). Deze kleine afname, samen met de afname van hyperploïde kernen, wordt gecompenseerd door een toename van hypoploïde niveaus (Tabel 1).
Anderzijds werd gerapporteerd dat de TZ in de apexwortel van maïs niet betrokken zijn bij mitotische delingen, en dat in deze zone postmitotische kernen zich op een centrale positie binnen de cel bevinden (Baluška et al., 2001). Bovendien zijn er geen mitotische figuren waargenomen langsheen de wortelzone; zijwortelprimordia initiatie werd waargenomen tussen 20-25 mm van RCJ (Alarcón et al., 2016). In Arabidopsis is de gemiddelde afstand tot de vroegste mitose in de pericycle 3194 µm en de eerste mitose is waargenomen op 2205 µm van de worteltop (Dubrovsky et al., 2001). In maïswortel vertoonden sommige pericyclus tegenover xyleemcellen pas op 20-30 mm van RCJ gecondenseerd cytoplasma, wat erop wijst dat ze opnieuw de celcyclus ingaan (Alarcón et al., 2016). Deze verschillen kunnen worden veroorzaakt door de grotere elongatie wortelsnelheid in maïs die 80-90 mm/dag groeit, terwijl Arabidopsis slechts 10 mm/dag elongeert (Dubrovsky et al., 2001).
Het is aangetoond met behulp van een weefselspecifieke kwantitatieve microscopische analyse dat sommige cellen van cortex en epidermis zich in de eerste endocyclus bevonden (DNA-gehaltes tussen 4C en 8C) bij het begin van hun elongatie. Bovendien bereikten kernen van metaxylem-elementen in de overgangszone een of twee endocycli 32C bij het begin van hun snelle rek (Baluška, 1987, 1990; Baluška en Kubica, 1984; Baluška et al., 1995). Onlangs werd beschreven dat endoreduplicatie in planten optreedt voordat de cellen beginnen te differentiëren (De Veylder et al., 2007). Wij hebben echter geen relevant aantal kernen waargenomen met een ploïdie niveau hoger dan 4n. Bovendien, als endoreduplicatie een algemeen proces was in de worteltop van maïs, zouden we verwachten dat hyperploïdie zou toenemen naarmate we zones analyseerden die verder verwijderd waren van RCJ. De hyperploïdie nam echter niet alleen niet toe in de elongatiezones, maar nam zelfs af (Tabel 1).
Er is gemeld dat de pericycluscellen in de G1-fase blijven tot ze opnieuw de celcyclus ingaan (Vanneste et al., 2007). De pericycluscellen vertegenwoordigen echter slechts een klein deel van de totale hoeveelheid cellen die de worteltoppen vormen; epidermale en cortexcellen zijn de meest overvloedige celtypes in de wortel-apex. Als ongeveer 70% van alle cellen de meristeem verlaten in de G2-fase, dan moeten de meeste epidermale en cortex cellen in G2 zijn als ze de meristeem verlaten. Aangenomen wordt dat epidermale en cortexcelstrekking de lengtegroei van de wortel controleren (Alarcón et al., 2014b). Daarom moeten cellen die betrokken zijn bij het differentiatieproces dat resulteert in wortelstrekking zich in de G2-fase bevinden.