3.1 Endogenne enzymy ryb
Jak omówiono powyżej, różne enzymy proteolityczne znajdują się w trzewiach, przewodzie pokarmowym i tkance mięśniowej ryb.
Głównymi endogennymi proteinazami w sardelach były: trypsynopodobna proteinaza, pepsyna, chymotrypsyna, elastaza i aminopeptydaza (Martinez & Serra, 1989; Siringan, Raksakulthai, & Yongsawatdigul, 2006). Enzymy trawienne trypsyny, chymotrypsyny i pepsyny są uważane za trzy ważniejsze enzymy w porównaniu z innymi (de la Parra, Rosas, Lazo, & Viana, 2007). Pepsyna znajduje się zwykle w żołądku ryb i jest głównym enzymem soków trawiennych (de la Parra i in., 2007). Trypsyna jest obecna w trzewiach, ślepej kiszce i śledzionie (Kishimura, Hayashi, Miyashita, Nonami, 2005, 2006; Kishimura et al., 2007; Klomklao et al., 2006). Wątroba i trzustka organów trawiennych ryb i skorupiaków zawiera zarówno aktywności peptydaz, jak i proteinaz, takich jak aminopeptydazy, proteazy żelatynolityczne, trypsyna i chymotrypsyna oraz proteazy kolagenolityczne (Sriket, 2014).
Stwierdzono, że większość aktywności lipolizy i proteolizy w przetwórstwie peda odnotowano w jelitach, zwłaszcza na początku procesu fermentacji; jednak aktywności te szybko spadały w trakcie procesu (Irianto, 1990). Z uwagi na fakt, że enzymy znajdują się w trzewiach i przewodzie pokarmowym, wypatroszenie odgrywa ważną rolę w określeniu tempa i rodzaju zachodzącej degradacji enzymatycznej. Fermentowane produkty rybne przetwarzane przy użyciu całej ryby będą miały inne właściwości niż te wytwarzane z ryb pozbawionych głowy i wypatroszonych (Wheaton & Lawson, 1985). Aktywność enzymatyczna większości enzymów trzewi i przewodu pokarmowego ryb wykazywała największą aktywność przy wartościach pH zbliżonych do neutralnych (Bougatef i in., 2007; Munilla-Moran & Saborido-Rey, 1996).
Castillo-Yañez, Pacheco-Aguilar, Garcia-Carreño i Toro (2004) wyizolowali z trzewi sardynek kwaśny enzym proteolityczny, należący do klasy proteaz asparaginowych. Enzym ten jest podobny do pepsyny II z innych gatunków ryb i jest stabilny w pH 3-6 i 45°C.
Śledziona odźwiernika to narządy, które są głównym źródłem proteinaz alkalicznych. Enzym podobny do trypsyny otrzymany z odźwiernika ślepej kiszki dorsza (G. morhua) miał punkt izoelektryczny 5,30 i 5,89 i był bardzo podobny w składzie aminokwasowym do trypsyny wołowej, ale różnił się większą względną ilością aminokwasów kwaśnych i mniejszą ilością aminokwasów zasadowych. Enzym ten hydrolizował również substraty białkowe ryb (Beirão, Mackie, Teixeira, & Damian, 2001).
Trzy proteinazy alkaliczne i dwie proteinazy kwaśne zostały wyizolowane z sardynki. Każda z proteinaz alkalicznych hydrolizowała kazeinę szybciej niż inne białka. Główna proteinaza alkaliczna (III) hydrolizowała białka sarkoplazmatyczne sardynek pięciokrotnie szybciej niż inne proteinazy alkaliczne. Każda z dwóch proteinaz kwaśnych hydrolizowała hemoglobinę i mioglobinę szybciej niż pozostałe białka. Po preinkubacji z 25% NaCl, proteinaza alkaliczna (III) i proteinaza kwaśna (II) były stabilne, podczas gdy pozostałe proteinazy stały się niestabilne. Dwie proteinazy, proteinaza alkaliczna III i proteinaza kwaśna II, były również stabilne przez 3 miesiące od rozpoczęcia produkcji sosu rybnego. Aktywność proteolityczna każdej z proteinaz alkalicznych i kwaśnych była silnie hamowana przez więcej niż 15% NaCl; jednak minimalne zahamowanie obserwowano, gdy jako substratu używano białek mięśni sardynek (Noda, Van, Kusakabe, & Murakami, 1982).
Dwie aminopeptydazy (I i II) zostały wyekstrahowane z odtłuszczonych organów wewnętrznych sardynek i oczyszczone przy użyciu chromatografii DEAE-celulozowej, filtracji żelowej na Sephadex G-200 i ogniskowania izoelektrycznego. Ostateczne preparaty enzymów I i II uznano za prawie jednorodne w procesie elektroforezy na żelu poliakrylamidowym. Masy cząsteczkowe enzymów I i II zostały określone przez filtrację żelową odpowiednio na 370 000 i 320 000. Punkty izoelektryczne wynosiły odpowiednio 4,1 (I) i 4,8 (II). Oba enzymy były hamowane przez EDTA i aktywowane przez Co++. Bestatyna mogła hamować enzym I, ale nie enzym II. Enzymy I i II szybko hydrolizowały nie tylko syntetyczne substraty zawierające alaninę lub leucynę, ale także di-, tri- i tetra-alaninę. W oparciu o wszystkie te cechy, aminopeptydazy sardyny przypominają ludzką aminopeptydazę alaninową. Enzym I zachował ponad 70% swojej pierwotnej aktywności w 15% NaCl, co sugeruje, że enzym bierze udział w hydrolizie białek i peptydów rybnych podczas produkcji sosu rybnego (Vo Van, Kusakabe, & Murakami, 1983).
Aktywność proteinaz alkalicznych i kwaśnych porównano z trypsyną bydlęcą i pepsyną i wykazano, że podobnie jak trypsyna bydlęca, proteinaza alkaliczna z odźwiernika sardynek hydrolizuje kazeinę skuteczniej niż inne substraty białkowe (Noda i in., 1982).
Ezymy tkanki mięśniowej, w szczególności katepsyny, peptydazy, transaminazy, amidazy, dekarboksylazy aminokwasowe, dehydrogenazy glutaminianowe i enzymy pokrewne, występują w tkance mięśniowej ryb (Chaveesuk, 1991), a enzymy te, w szczególności trypsyna, chymotrypsyna i katepsyna, biorą udział w hydrolizie białek podczas fermentacji sosu rybnego (Fernandes, 2016). Enzymy tkanki mięśniowej zlokalizowane są głównie w komórkach. Z drugiej strony, enzymy trawienne są wydzielane pozakomórkowo. Chociaż niektóre badania wykazały, że enzymy tkanki mięśniowej mają optymalną aktywność przy neutralnym pH, większość doniesień informuje, że niskie wartości pH przyspieszają aktywność enzymów tkanki mięśniowej. Większość fermentowanych produktów rybnych jest przetwarzana przy pH powyżej 4, z wyjątkiem kiszonki rybnej i niektórych fermentowanych produktów rybnych. W związku z tym, większość enzymów tkanki mięśniowej w rzeczywistości nie znajduje się w optymalnym stanie pH (Mackie i in., 1971).
Częściowa charakterystyka katepsyn B z mięśnia ostroboka pospolitego wskazała na podobne cechy z innymi katepsynami BS. Optymalne pH katepsyny wynosiło 5, a optymalna temperatura 50°C. Aktywność katepsyny była hamowana przez E-64. Aktywność była hamowana przez E-64, CA-074 i chymostatynę (Yoshida i in., 2015).
Maksymalną aktywność enzymów można uzyskać stosując całe ryby, w tym głowy i wnętrzności. Przeciwnie, minimalna aktywność enzymów wystąpi, gdy pozbawione głowy i wypatroszone ryby są używane do produkcji fermentowanych produktów rybnych. Tymczasem pośrednią aktywność enzymów można uzyskać poprzez usunięcie wnętrzności w dowolnym momencie po złowieniu ryby, aby umożliwić dyfuzję enzymów trzewiowych do tkanek (Owens & Mendoza, 1985).
W solonych rybach, dojrzewanie jest opisywane przez trzy hipotezy. Są to: (1) teoria mikrobiologiczna, (2) teoria autolityczna i (3) teoria enzymatyczna. W teorii mikrobiologicznej mikroorganizmy wytwarzają niezbędne aktywne enzymy, które wnikają do wnętrza mięsa i przyczyniają się do procesu dojrzewania. Teoria autolityczna opisuje, że dojrzewanie jest wynikiem działania enzymów mięśni, innych tkanek lub przewodu pokarmowego. Wreszcie teoria enzymatyczna wyjaśnia dojrzewanie solonych ryb jako zachodzące pod wpływem określonych enzymów, a mianowicie enzymów zawartych w tkance mięśniowej, enzymów znajdujących się w narządach ciała jelitowego ryby, wraz z enzymami wytwarzanymi przez mikroorganizmy (Mackie i in., 1971).
W dojrzewaniu sardeli maksymalną aktywność autolityczną sardeli indyjskiej (Stolephorus indicus) stwierdzono w temperaturze 60°C. Aktywność autolityczna malała wraz ze wzrostem stężenia NaCl. Surowy ekstrakt wykazywał optimum pH w zakresie 8,5-9,5. Dominującymi proteinazami w surowym ekstrakcie były proteinazy trypsynopodobne. Proteinazy z sardeli indyjskiej mogą uczestniczyć w hydrolizie białek podczas fermentacji sosu rybnego. Dlatego inkubacja sardeli indyjskiej w temperaturze 60°C i w 10% NaCl przez pewien okres czasu przed pełnym zasoleniem w 25% NaCl może być skutecznym sposobem na przyspieszenie procesu fermentacji sosu rybnego (Siringan i in., 2006).