Abstract

Celem tej pracy było zbadanie antyhiperlipidemicznych i antyoksydacyjnych potencjałów ekstraktu z cebuli (Allium cepa L.) fermentowanego z nowym Lactobacillus casei HD-010. Generalnie, ekstrakt z cebuli poddany fermentacji jest wykorzystywany ze względu na swoją aktywność antyoksydacyjną (ORAC), hamujący wpływ na różnicowanie adipocytów, zawartość kwercetyny oraz działanie antyhiperlipidemiczne. Jednakże, wpływ ekstraktu z fermentowanej cebuli na hiperlipidemię po podaniu doustnym myszom z niedoborem ApoE nie został jeszcze opisany. Aby zrozumieć wpływ ekstraktu ze sfermentowanej cebuli na hiperlipidemię, użyliśmy benzafibratu (10 mg/kg m.c./dzień) jako pozytywnej kontroli w obecnym badaniu. Surowica była pobierana co tydzień w celu analizy poziomu lipoprotein o niskiej gęstości (LDL), lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL), triglicerydów (TG) i cholesterolu, aktywności reduktazy 3-hydroksy-3-metyloglutaryi-CoA (HMG-CoA) oraz aktywności białka transportującego estry cholesterolu (CETP). W grupie poddanej działaniu fermentowanej cebuli poziom HDL był istotnie podwyższony, podczas gdy poziom TG i LDL był istotnie obniżony w porównaniu z grupą kontrolną. Ponadto, aktywność hamowania reduktazy HMG-CoA była zwiększona o 20% w grupie leczonej fermentowaną cebulą w dawce 100 mg/kg. Aktywność CETP została zaobserwowana jako znacząco zahamowana w grupach leczonych fermentowaną cebulą w porównaniu do grupy kontrolnej. Wyniki te sugerują, że sfermentowana cebula ma działanie prewencyjne/terapeutyczne w chorobie hiperlipidemicznej. Może ona mieć potencjał do rozwoju jako żywność funkcjonalna.

1. Introduction

Recently, food consumption pattern has considerably changed from traditional fermented food-based intake (Kimchi, fermented soy bean, etc.) to fat containing westernnized diet (meat, fats, etc.) in Asia, including Korea . Zachodni wzór spożycia żywności jest znany, aby zwiększyć ryzyko otyłości, wysokie ciśnienie krwi, cukrzyca i hiperlipidemia . Hiperlipidemia jest czynnikiem ryzyka chorób układu sercowo-naczyniowego. Kontrolowanie hipercholesterolemii jest ważne dla zapobiegania hiperlipidemii. Zmniejszenie stężenia triglicerydów w krwiobiegu jest jedną z metod leczenia pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi poprzez indukcję receptorów LDL i ograniczenie wydzielania VLDL za pomocą niektórych leków.

Istnieje kilka leków zmniejszających objawy hiperlipidemii, takich jak inhibitor reduktazy HMG-CoA (statyny), aktywator PPAR-alfa (fibrat), inhibitor CETP, sekwestranty kwasów żółciowych i inhibitor ACAT. Długotrwałe leczenie tymi lekami wiąże się jednak z działaniami niepożądanymi. Dlatego w wielu badaniach starano się zwiększyć skuteczność leków .

Zmniejszenie stężenia cholesterolu we krwi jest ważnym zagadnieniem badawczym w rozwoju żywności funkcjonalnej i leków w celu zmniejszenia ryzyka chorób związanych z układem sercowo-naczyniowym. Naturalne składniki pochodzące z roślin lub organizmów są potencjalnymi kandydatami do zmniejszenia ryzyka wystąpienia choroby. Cebula (Allium cepa L.) jest wykorzystywana do obniżania poziomu cholesterolu we krwi. W Azji była tradycyjnie stosowana jako lek ze względu na działanie obniżające gorączkę, przeciwpasożytnicze, detoksykacyjne i przeciwzapalne jelit. Główne związki zawarte w cebuli to flawonoidy (kwercetyna, kwercytryna i rutyna) oraz związki siarkowe (dwusiarczek allilopropylowy, dwusiarczek diallilowy) o działaniu poprawiającym zdrowie. Inną metodą obniżenia cholesterolu jest zastosowanie bakterii Lactobacillus do fermentacji. Lactobacillus został przebadany pod kątem jego działania obniżającego poziom cholesterolu. Klaver i wsp. donoszą, że Lactobacillus może dekonjugować kwas żółciowy i hamować funkcję cholesterolu. Jednak wpływ ekstraktu ze sfermentowanej cebuli na hiperlipidemię po podaniu doustnym myszom z niedoborem ApoE nie został jeszcze opisany. Dlatego celem niniejszej pracy było zbadanie antyhiperlipidemicznego i antyoksydacyjnego potencjału fermentowanej cebuli (Allium cepa L.) z nowym szczepem Lactobacillus casei HD-010 w metabolizmie lipidów.

2. Materiały i Metody

2.1. Wybór szczepu bakteryjnego i warunków hodowli

Zidentyfikowano dziesięć szczepów z fermentowanej cebuli, a głównym szczepem był Lactobacillus casei HD-010 (Tabela 1). Jako kontrolę pozytywną zastosowano L. casei KCTC 2180 z Korean Collection for Type Cultures. Zidentyfikowany szczep L. casei HD-010 był hodowany w temperaturze 30°C przez 10 dni w celu fermentacji ekstraktu z cebuli. Ekstrakt z cebuli przygotowywano ze zmielonej, czystej cebuli po trzykrotnym przemyciu podwójną wodą destylowaną. Do fermentacji użyto autoklawowanego ekstraktu z cebuli w temperaturze 121°C przez 15 minut. Podłoże do identyfikacji szczepów przygotowano z 5,5% bulionu MRS (Difco, Francja) z 2,0% agarem (Difco, Francja). Płynne podłoża hodowlane przygotowywano jak podłoża do identyfikacji szczepów bez 2,0% agaru.

2.2. Przygotowanie fermentowanego ekstraktu cebuli

Do fermentacji ekstraktu cebuli użyto 30-litrowego fermentora (Biostat C Plus, Sartorius, Szwecja) z 100% ekstraktem cebuli w warunkach sterylnych. Po schłodzeniu ekstraktu cebuli, 1% HD-010, który był inkubowany w temperaturze 37°C z wytrząsaniem (200 rpm) przez 24 godziny, zaszczepiono do fermentora i hodowano w temperaturze 37°C z wytrząsaniem (25 rpm) przez 10 dni. Po przefiltrowaniu ekstraktu ze sfermentowanej cebuli za pomocą filtra (wielkość porów 0,2 μm), ekstrakt był liofilizowany (PVTFD20RS, Ilshin Lab. Co. Ltd., Korea) i przechowywany w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia eksperymentu. Jako kontrolę pozytywną zastosowano L. casei KCTC 2180. Przygotowano ją tą samą metodą, co L. casei HD-010.

2.3. Oznaczanie zdolności absorpcji rodników tlenowych (ORAC)

Zdolności antyoksydacyjne fermentowanej cebuli, warstw rozpuszczalników organicznych, frakcji i podfrakcji określono przy użyciu testu ORAC, jak opisano w Gillespie i wsp. W skrócie, próbki lub Trolox (0, 6.25, 12.5, 25, 50 i 100 μg/ml) mieszano z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (75 mmol/L, pH 7.4, Thermofisher scientific, Waltham, MA, USA). Po dodaniu β-fikoerytryny (0,2 mmol/L) i 2,2′-azobis(2-amidynopropan) dihydrochlorku (AAPH, 200 mmol/L, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japonia) jako generatorów rodników dodawano do dołków 96-dołkowej płytki. Fluorescencję mierzono za pomocą czytnika fluorescencyjnego ELISA (VICTOR®, PerkinElmer, USA) co dwie minuty przez sześćdziesiąt minut (długość fali wzbudzenia: 535 nm, długość fali emisji: 590 nm). Równanie użyte do uzyskania AUC (obszar pod krzywą) było następujące:

gdzie f0 było początkowym odczytem fluorescencji w 0 minucie, a fi było odczytem fluorescencji w i (od 1 do 60) minucie.

2.4. Adipocyt Cell Culture and Differentiation

We purchased 3T3-L1 cell lines from the American Type Culture Collection (ATCC, USA). Komórki preadipocytów 3T3-L1 były umieszczane na płytkach 96-dołkowych w gęstości 1 × 104 komórek na dołek. Hodowano je w temperaturze 37°C przy 5% CO2 w podłożu Dulbeco’s Modified Eagle Media (DMEM, Gibco, Invitrogen, USA) uzupełnionym 10% surowicą cielęcą noworodków (Gibco, Invitrogen, USA) i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny (Gibco, Invitrogen, USA). Następnie komórki preadipocytów 3T3-L1 hodowano w medium różnicującym (MDI) zawierającym 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS, Gibco), 10 μg/ml insuliny (Sigma-Aldrich), 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX, Sigma-Aldrich) i 1 μM deksametazonu (Sigma-Aldrich). Dwa dni po stymulacji induktorem różnicowania (MDI, zawierającym 0,5 mM IBMX, 1 μM deksametazonu i 10 μg/ml insuliny), pożywkę zmieniano na DMEM zawierający 10% FBS i 10 μg/ml insuliny. Dwa dni później pożywkę ponownie zmieniono na 10% FBS/DMEM. Komórki były hodowane w 10% FBS/DMEM co dwa dni. Pełne zróżnicowanie zostało osiągnięte w 8. dniu. Próbki ekstraktu z cebuli dodawano do hodowli komórek 3T3-L1 w różnych stężeniach (6,25 ~ 100 μg/ml) w cztery dni po indukcji różnicowania.

Wewnątrzkomórkową zawartość lipidów mierzono na płytkach 96-dołkowych przy użyciu odczynnika AdipoRed™ (Cambrex, MA, USA). W dniu 8, medium do leczenia zostało usunięte, a komórki zostały utrwalone w 4% roztworze formaldehydu w temperaturze pokojowej (25 ° C) przez 5 godzin. Po przepłukaniu komórek PBS, do każdej studzienki dodawano 200 μl PBS i 5 μl odczynnika AdipoRed. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 min, płytki były mierzone za pomocą czytnika fluorescencji ELISA (VICTOR®, PerkinElmer, USA) przy długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 535 nm. Wartości z każdej grupy zostały wykorzystane do obliczenia 50% skutecznego stężenia hamującego (EC50) dla zmniejszenia różnicowania adipocytów. Jako kontrole pozytywne zastosowano benzafibrat i simwastatynę.

2.5. Separation and Fractionation of Onion Extract Fermented with L. casei HD-010

Liofilizowane ekstrakty fermentowanej cebuli zostały ponownie zawieszone w wodzie destylowanej i rozdzielone czterema różnymi rozpuszczalnikami organicznymi (n-heksan, CH2Cl2, octan etylu, i n-butanol) i pozostałą H2O. Frakcje te poddawano wzbogacaniu dekompresyjnemu i liofilizacji w celu usunięcia pozostałości rozpuszczalnika. Warstwy CH2Cl2 były kolejno stosowane do chromatografii HP-20, żelu krzemionkowego i otwartej chromatografii kolumnowej RP-C18 w tych samych warunkach kolumny (3,8 x 60 cm, 300 g) w celu uzyskania aktywnego związku z fermentowanej cebuli z L. casei HD-010 (LFAc).

2.6. Zawartość kwercetyny

Zawartość kwercetyny w ekstraktach z fermentowanej cebuli analizowano ilościowo metodą analitycznej HPLC (system Shimadzu CBM-20A Network LC z pompą LC-6AD, detektorem SPD-M20APDA, wyposażony w automatyczny próbnik cieczy serii SIL-10AF). Kolumnę Eclipse Plus-C18 (Agilent, 3,0 x 100 mm, 0,35 μm) stosowano w następujących warunkach: szybkość przepływu, 1,0 ml/min; całkowita długość przebiegu, 30 minut; faza ruchoma 90% ACN plus 0,02 M KH2PO4 (pH 2,0 z H3PO4); objętość iniekcji próbek lub STD, 20 μl; długość fali, 372 nm. Quercetin (Q4951) był używany jako porównawczy standard pochodnej (nr CAS 117-39-5, Sigma-Aldrich, USA)

2.7. Eksperymenty na zwierzętach

Myszy z niedoborem ApoE (w wieku pięciu tygodni) dostarczono z Central Laboratory Animal Inc. w Korei i trzymano w temperaturze 23 ± 0,5°C przy wilgotności 55 ± 7% i cyklu światło-ciemność (12 godz. : 12 godz.). Wszystkie zwierzęta były aklimatyzowane przez co najmniej tydzień. Były one trzymane w klatkach i karmione dietą kontrolną o niskiej zawartości tłuszczu i cholesterolu D12336 (Central Laboratory Animal Inc., Seul, Korea).

Wszystkie badania na zwierzętach przeprowadzono w strefie barierowej wolnej od patogenów na Kyungpook National University. Wszystkie procedury stosowane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Animal Care and Use Committee of Kyungpook National University (numer zatwierdzenia IACUC: KNU2012-136).

Grupa kontrolna była karmiona dietą o wysokiej zawartości tłuszczu. Grupa kontroli pozytywnej była karmiona benzafibratem (10 mg/kg). Ekstrakt ze sfermentowanej cebuli podawano w trzech grupach w różnych ilościach doustnie w 0,5 ml soli fizjologicznej (niska dawka, 25 mg/kg; średnia dawka, 50 mg/kg; i wysoka dawka, 100 mg/kg). Grupa z samą solą fizjologiczną została użyta jako kontrola negatywna (N=10/grupa). Projekt doświadczenia na zwierzętach w tym badaniu przedstawiono na rysunku 1.

Rysunek 1

Projekt doświadczenia na zwierzętach.

2.7.1. Pomiar zawartości lipidów

Krew pobierano od myszy metodą krwawienia z zatoki zaoczodołowej z wykorzystaniem splotu żylnego wewnątrzoczodołowego co tydzień przez sześć tygodni. Próbki krwi inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut i odwirowywano przy 600 g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Próbki surowicy były przygotowywane i przechowywane w temperaturze -80°C do czasu wykonania oznaczeń. Aktywność inhibicji reduktazy HMG-CoA i CETP mierzono w próbkach surowicy pobranych w ostatnim punkcie eksperymentalnym (próbki tygodniowe). Aktywność reduktazy HMG-CoA i inhibicji CETP mierzono przy użyciu odpowiednio zestawu do oznaczania reduktazy HMG-CoA (Sigma, USA) i zestawu do oznaczania CETP (Biovision, USA). W surowicy oznaczono zawartość cholesterolu całkowitego (TC), cholesterolu LDL (LDL-C), cholesterolu HDL (HDL-C), triglicerydów (TG) przy użyciu zestawu Asan (firma medyczna Asan, Korea) i analizatora biochemicznego Beckman Coulter.

2.8. Analiza statystyczna

Wyniki przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (mean ± SD). Do analizy statystycznej danych zastosowano test t-Studenta z dwoma ogonami.

3. Wyniki i Dyskusja

3.1. Fermented Onion Exhibits Antioxidative Activity

Badaliśmy aktywność antyoksydacyjną ekstraktu cebuli fermentowanej z L. casei HD-010 (LFAc) za pomocą testu ORAC. LFAc miał wyższą wartość ORAC niż Trolox, kontrola pozytywna (ORAC ekstraktu LFAc = 1,02).

W celu określenia, które frakcje ekstraktów cebuli fermentowanej z L. casei HD-010 zawierały składniki przeciwutleniające, rozdzieliliśmy dalej ekstrakt używając czterech różnych rozpuszczalników organicznych, jak opisano w sekcji Materiały i Metody. Frakcje LFAc-EtOAc miały najwyższą wartość ORAC (ORAC z LFAc-EtOAc = 1,12) (Rysunek 2), sugerując, że frakcje EtOAc ekstraktu cebuli fermentowanej z L. casei HD-010 (LFAc) zawierały składnik antyoksydacyjny. Wynik ten sugeruje, że ekstrakt cebuli fermentowanej z L, casei HD-010 (LFAc) posiada aktywność antyoksydacyjną.

Rysunek 2

Aktywność antyoksydacyjna frakcji ekstraktu cebuli fermentowanej z L. caseiHD-010 (LFAc) przy użyciu rozpuszczalników organicznych. Uzyskano wartości zdolności absorpcji rodników tlenowych (ORACPE) w teście antyoksydacyjnym z użyciem różnych frakcji rozpuszczalnika organicznego. Trolox był używany jako kontrola pozytywna (wartość ORAC wynosiła 1,00). Dane przedstawiono jako średnie ± SD (n = 3). #p<0,05 versus grupa kontrolna (grupa leczona FO); ##p<0,05 versus grupa kontrolna (grupa leczona AO); ###p<0,05 versus grupa leczona LFAc; p<0,05 versus pozytywna grupa kontrolna (L. casei KCTC 2180 treated group); p<0,05 versus kontrola pozytywna (grupa traktowana Troloxem); FO, cebula świeża; AO, cebula autoklawowana; LFAc, cebula fermentowana z L. casei HD-010; Hx, n-heksan; CH2Cl2, dichlorometan; EtOAc, octan etylu; BuOH, n-butanol; L. casei KCTC 2180, fermentowana cebula z L. casei KCTC 2180.

3.2. Inhibicja różnicowania adipocytów

Cebula fermentowana z L. casei HD-010 (LFAc) wykazała hamujący wpływ na różnicowanie adipocytów w porównaniu z cebulą świeżą lub autoklawowaną (> 20%). Hamujący efekt LFAc był szczególnie obserwowany w warstwie CH2Cl2 (> 45%) (Figura 3). Jako kontrola pozytywna, benzafibrat nie miał wpływu na różnicowanie. Jednak leczenie simwastatyną wykazało ponad 90% inhibicję różnicowania. Dlatego LFAc ma funkcję hamującą poprzez blokowanie aktywności reduktazy HMG-CoA.

Rysunek 3

Hamowanie różnicowania lipocytów przez ekstrakt z cebuli (Allium cepa L.) fermentowany z L. casei HD-010 (LFAc). Dane przedstawione są jako średnie ± SD (n = 3). p<0.05 versus FO, AO, LFAc, lub LFAc-Hx treated group; #p<0.05 versus positive control (benzafibrate treated group); ##p<0.01 versus positive control (benzafibrate treated group). FO, cebula świeża; AO, cebula w autoklawie; LFAc, cebula fermentowana z L. casei HD-010; Hx, n-heksan; CH2Cl2, dichlorometan; EtOAc, octan etylu; BuOH, n-butanol.

3.3. Dichloromethane Layers of Onion Extract Fermented with L. casei HD-010 (LFAc) Have Both Adipocytes Differentiation Inhibiting and Antioxidative Effects

W celu oczyszczenia i zidentyfikowania aktywnego związku w LFAc dla indukcji aktywności fizjologicznej, CH2Cl2layers poddano kilku procedurom izolacji (HP-20, Silica gel, and RP-C18 open column). Frakcje HLFAc-30 i SLFAc-4 o silnej aktywności hamującej różnicowanie adipocytów otrzymano kolejno (data nie pokazana) po dalszej izolacji frakcji SLFAc-4 w otwartej kolumnie RP-C18.

W celu zbadania funkcji hamowania hiperlipidemii po LFAc, frakcję MC poddano chromatografii HP-20, żelu krzemionkowego i otwartej chromatografii RP-18. Działanie antyoksydacyjne i hamujące różnicowanie adipocytów obserwowano dla frakcji LFAc-HP3 z HP-20, LFAc-S4 z żelu krzemionkowego i LFAc-C3 z C1 (tab. 2).

Próbki Inhibicja (EC50 = μg/ml) ORAC LFAc_CH2Cl2 53.25 1,10 ± 0,015 LFAc_C1 53,41 1,06 ± 0,028 LFAc_C2 56.56 1.04 ± 0.013 LFAc_C3 40.25 1.15 ± 0.021 LFAc_C4 42.98 1.16 ± 0.057 LFAc_C5 >100 ND Trolox ND 1.00 ± 0,017

Dane przedstawiono jako średnie ± SD (n = 3); p<0,05 versus grupa kontrolna (grupa leczona PBS); p<0,05 versus kontrola pozytywna (grupa leczona Troloxem). ND (nie wykryto).

Tabela 2

Zahamowanie różnicowania lipocytów i aktywność antyoksydacyjna podfrakcji z LFAc_S4 przy użyciu otwartej kolumny C18.

3.4. Zawartość kwercetyny

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) została użyta do rozdzielenia składników z surowego ekstraktu cebuli (FO), sterylizowanego ekstraktu cebuli (AO) i fermentowanego ekstraktu cebuli (LFAc). Wzór nie różnił się pomiędzy próbkami i znaleziono cztery główne plamy (dane nie pokazane). Frakcja LFAc-C4 wykazała najlepszy efekt hamujący różnicowanie adipocytów i zidentyfikowano skuteczną pojedynczą frakcję. Kwercetyna, jeden z głównych składników cebuli, została zidentyfikowana z frakcji LFAc-C4. FO, AO, LFAc i LFAc_CH2Cl2 zostały zbadane za pomocą HPLC. Zawartość kwercetyny w tych frakcjach wynosiła: FO – 3,90 ± 0,041 mg/ml; AO – 7,13 ± 0,009 mg/ml; LFAc – 2,89 ± 0,064 mg/ml; LFAc_CH2Cl2 – 20,53 ± 0,304 mg/ml. Zawartość kwercetyny nie zmieniała się w zależności od sposobu fermentacji. Jednakże, po fermentacji z probiotykami, zawartość kwercetyny była zwiększona prawie 10-krotnie w LFAc-CH2Cl2 (Rysunek 4).

Rysunek 4

Ilościowa zawartość kwercetyny w ekstrakcie cebuli (Allium cepa L.) z lub bez fermentacji z wykorzystaniem analizy HPLC. Dane przedstawiono jako średnie ± SD (n = 3). FO, cebula świeża; AO, cebula autoklawowana; LFAc, cebula fermentowana z L. casei HD-010; CH2Cl2, dichlorometan.

3.5. Badania na zwierzętach

3.5.1. Masa ciała

Wpływ ekstraktu ze sfermentowanej cebuli na masę ciała badano przez sześć tygodni, stosując u myszy dietę wysokotłuszczową. W grupie karmionej fermentowanym ekstraktem z cebuli zaobserwowano znaczący spadek masy ciała. Błonnik pokarmowy, flawonoidy i składniki siarkowe zawarte w cebuli skutecznie zmniejszyły masę ciała w porównaniu do grupy karmionej samą dietą wysokotłuszczową (dane nie pokazane). Wynik ten sugeruje, że doustne podawanie sfermentowanego ekstraktu z cebuli nie ma bezpośredniego wpływu na masę ciała, zgodnie z innymi badaniami .

3.5.2. Pomiar zawartości lipidów w surowicy

Surowica była pobierana co tydzień przez sześć tygodni i oceniana pod kątem zmian w zawartości LDL-C, HDL-C, TG i TC. Na koniec eksperymentu surowica była badana pod kątem efektu hamowania reduktazy HMG-CoA i CETP. Grupy karmione fermentowanym ekstraktem z cebuli (niska, średnia i wysoka) wykazywały istotne obniżenie poziomu LDL-C od piątego tygodnia. W grupach żywionych średnią i wysoką dawką fermentowanego wyciągu z cebuli obserwowano stały spadek masy ciała (tab. 3). Ponadto, poziom HDL-C wzrastał od pierwszego tygodnia do szóstego tygodnia po podaniu ekstraktu (Tabela 4). Grupa karmiona supernatantem LSP-11 wykazała znaczące zmiany w poziomie HDL-C i LDL-C w trzecim i piątym tygodniu. Dane te sugerują, że ekstrakt z fermentowanej cebuli może mieć synergistyczny wpływ na funkcje metabolitów wtórnych z Lactobacillus casei HD-010.

Traktowanie Dawka (mg/kg/dobę) Lipoproteina o niskiej gęstości (LDL, mg/dl) 0 tygodni 1 tydzień 2 tygodnie 3 tygodnie 4 tygodnie 4 tygodnie 5 tygodni 6 tygodni Kontrola 0 575.9±51.05 620.0±96.49 536.6±93.56 621.9±47.44 509.8±67.23 675.9±54.93 592.4±37.39 Low 25 581.4±81.00 624.1±58.78 462.3±72.85# 624.4±26.62 484.6±52.17# 517.0±92.00 553.5±40.53 Mid 50 532.6±81.58 605.1±63.79 441.3±72.70# 597.1±55,23# 477,1±98,76# 486,7±59,18# 547,4±31,61# Wysokie 100 517.0±39.48 595.9±64.42 336.4±62.60 591.0±89.04## 454.9±20.30## 484.2±69.66 500.3±77.92 L. casei KCTC 2180 100 612.6±60.79 677.9±114.79 593.6±47.41 723.1±28.63 625.6±55.93 685.7±72.79 624.0±26.55 Benzafibrat 10 597.3±90.47 581.8±40.11 513.4±67.09 652.3±83.81 649.9±69.99 652.4±76.33 590.0±24.63

Dane przedstawiono jako średnie ± SD (10 zwierząt w każdej grupie; przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty). Zawartość statystyczną pomiędzy wartościami kontrolnymi i leczonymi określono za pomocą dwuwarstwowego testu t-Studenta z wartością p; wartość p < 0.05 i p value < 0.001 (versus grupa kontrolna); #p value < 0.05 i ##p value < 0.001 (versus L. casei KCTC 2180 i grupa leczona benzafibratem).

Tabela 3

Wpływ fermentowanej cebuli z dodatkiem L. casei HD-010 na poziom lipoprotein o małej gęstości w surowicy krwi myszy z niedoborem ApoE.

Traktowanie Dawka (mg/kg/dzień) Lipoproteina o wysokiej gęstości (HDL, mg/ dl) 0 tygodni 1 tydzień 2 tygodnie 3 tygodnie 4 tygodnie 5 tygodni 6 tygodni Kontrola 0 45.5±7.41 47.1±1.05 44.3±8.95 50.8±3.20 36.0±4.23 31.4±4.43 44,8±2,27 Low 25 45,5±1,06 50,7±1,91 46,2±7,38 57,4±1.28 56.6±9.70 48.0±9.51 45.6±8.59 Mid 50 52.8±3.02 58.2±3.77 52.9±6.82## 65.3±0.92 58.6±4.10 51.8±3.41 56.2±7.73 Wysokie 100 56,6±8,96 64,2±6,00 55,4±6,81## 70,3±3,64 66,3±4,18 62.5±5.13 56.6±1.98 L. casei KCTC 2180 100 45.2±3.90 52.7±3.95 38.9±5.06 54,4±2,40 46,3±6,13 48,8±8,62 43,6±6,55 Benzafibrat 10 43.2±2.95 48.0±2.99 39.1±5.29 55.7±4.66 35.8±0.92 32.1±5.85 42.7±6.30

Dane przedstawiono jako średnie ± SD (10 zwierząt w grupie; przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty). Statystyczną istotność pomiędzy wartościami kontrolnymi i leczonymi określono za pomocą dwuwarstwowego testu t-Studenta i podano jako wartość p; p wartość < 0,05 i p wartość < 0,001(versus grupa kontrolna); #p wartość < 0,05 i ##p wartość < 0,001 (versus L. casei KCTC 2180 i grupa leczona benzafibratem).

Tabela 4

Wpływ fermentowanej cebuli z L. casei HD-010 na poziom lipoprotein o dużej gęstości w surowicy u myszy z niedoborem ApoE.

Poziom TG w surowicy był nieznacznie obniżony we wszystkich grupach w porównaniu z poziomem w kontroli. Jednak spadek ten nie był istotny statystycznie. W szczególności w grupie żywionej wysoko fermentowanym ekstraktem z cebuli wykazano istotne obniżenie poziomu TG w pierwszym, drugim, trzecim i piątym tygodniu (Tabela 5). Poziom TC został obniżony w grupie żywionej fermentowanym ekstraktem z cebuli od piątego tygodnia (Tabela 6). Natomiast pozytywna grupa kontrolna, której podawano benzafibrat i supernatant Lactobacillus, nie wykazała istotnej różnicy w poziomie TC w porównaniu z grupą kontrolną.

. Traktowanie Dawka (mg/kg/dzień) Triglicerydy (TG, mg/ dl) 0 tygodni 1 tydzień 2 tygodnie 3 tygodnie 4 tygodnie 5 tygodni 6 tygodni Kontrola 0 406.6±35.68 561.2±54.01 334.4±60.37 652.3±65.16 302.3±48.56 412.2±75.99 284.8±54.11 Low 25 379.1±76.36 553.5±70.59 301.0±75.14 628.2±63.90 288.3±45,88 396,2±59,68 266,6±23,08 Mid 50 363.5±64.19 461.6±99.73 270.1±16.91 581.1±34.41 283.1±43.47 321.0±82.27 265.7±16.24 Wysokie 100 395.5±61.04 449.7±59.96 228.5±42.10 537.3±62.24 273.4±60.84 241.5±68.03 252.5±39.91 L. casei KCTC 2180 100 410.4±78.77 475.9±41.84 275.2±37.67 507.0±24.04 241.7±57.09 255.9±65.39 270.3±26.89 Benzafibrat 10 380.5±86.76 529.5±90.37 285.3±52.13 656.7±71.61 257.2±33.35 396.9±99.12 273.6±39.73

Dane przedstawiono jako średnie ± SD (10 zwierząt w grupie; przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty). Znaczoność statystyczną pomiędzy wartościami kontrolnymi i leczonymi określono za pomocą dwuwarstwowego testu t-Studenta i podano jako wartość p; wartość p < 0,05 i wartość p < 0,001.

Tabela 5

Wpływ fermentowanej cebuli z L. casei HD-010 na poziom triglicerydów w surowicy krwi myszy z niedoborem ApoE.

Treatment Dose (mg/kg/dzień) Total Cholesterol (TC, mg/dl) 0 tygodni 1 tydzień 2 tygodnie 3 tygodnie 4 tygodnie 5 tygodni 6 tygodni Kontrola 0 702.7±40.72 779.4±88.99 647.8±89.39 803.2±41.15 621.8±71.15 789.7±55.05 699.1±41.20 Low 25 702.7±88.48 785.5±63.45 568.7±82.61 807.5±19.50 598.8±46.83 644.3±79.84 644.8±39.13 Mid 50 658.1±73.41 755.7±51.34 548.3±67.92 778.6±57.04 592.3±91.15 602.7±62.89 641.1±60,00 Wysokie 100 652,7±28,06 750,1±60,31 437,4±61,70 768,7±83,53# 575,9±20,40# 595,0±73.14 619.4±78.28 L. casei KCTC 2180 100 739.9±48.37 825.8±113.75 687.6±52.21 879.0±32.08 720.2±66.89 785.8±79.01 715.2±33.01 Benzafibrat 10 716.6±90.81 735.7±26.94 609.5±66.18 839.3±92.52 737.1±73.97 763.9±87.42 687.4±19.36

Dane przedstawiają średnią ± SD(10 zwierząt na grupę; przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty). Statystyczną istotność między wartościami kontrolnymi i leczonymi określono za pomocą dwuwarstwowego testu t-Studenta i podano jako wartość p; p wartość < 0,05 i p wartość < 0,001(versus grupa kontrolna); #p wartość < 0,05 i ##p wartość < 0,001 (versus L. casei KCTC 2180 i grupa leczona benzafibratem).

Tabela 6

Wpływ fermentowanej cebuli z L. casei HD-010 na poziom cholesterolu całkowitego w surowicy krwi u myszy z niedoborem ApoE.

Użyliśmy modelu myszy z niedoborem ApoE w celu oceny skuteczności ekstraktu z fermentowanej cebuli na zmniejszenie akumulacji lipidów, hamowanie reduktazy HMG-CoA i hamowanie CETP. Reduktaza HMG-CoA jest zaangażowana w syntezę cholesterolu. Stwierdzono jej obniżenie po podaniu ekstraktu z cebuli fermentowanej. Spadek ten nie był jednak istotny statystycznie (Rycina 5). Białko CETP działa jako nośnik dla HDL i LDL do organizmu, a reduktaza HMG-CoA jest zaangażowana w syntezę cholesterolu. Jak pokazano na rycinie 5, aktywność CETP i reduktazy HMG-CoA były znacznie po podaniu ekstraktu z fermentowanej cebuli (Figura 5). Dane te sugerują, że ekstrakt ze sfermentowanej cebuli może skutecznie blokować adsorpcję tłuszczu jelitowego poprzez hamowanie aktywności CETP.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Rycina 5

Wpływ fermentowanej cebuli z dodatkiem L. caseiHD-010 na aktywność CETP i reduktazy HMG- CoA w surowicy myszy z niedoborem ApoE w wieku sześciu tygodni. Dane są przedstawione jako średnia ± SD (10 zwierząt w grupie; trzy niezależne eksperymenty zostały wykonane). Istotność statystyczną między wartościami nieleczonymi i leczonymi określono za pomocą dwuwargowego testu t-Studenta i podano jako wartość p; wartość p < 0,05 i wartość p < 0.001(versus control group); #p value < 0.05 and ##p value < 0.001 (versus L. casei KCTC 2180 and benzafibrate treated group).

Hyperlipidemia jest ważnym zagadnieniem w opiece zdrowotnej. Wiąże się ona z wieloma poważnymi chorobami układu sercowo-naczyniowego. Wiele badań eksperymentalnych i klinicznych wykazało, że hiperlipidemia może powodować nadciśnienie, cukrzycę i otyłość .

Wiele badań donosi, że składniki cebuli lub Lactobacillus mogą obniżyć zawartość lipidów we krwi. Cebula jest dobrze znaną tradycyjną medycyną. Była badana w wielu badaniach epidemiologicznych. W krajach azjatyckich, rośliny cebuli i czosnku, które zawierają siarczek diallilu i kwercetynę są używane do zapobiegania chorobom układu krążenia. Cebula zawiera około 90% wody, 7 ~8% cukru (głównie fruktozy) i niewielkie ilości witamin. Jednym ze składników cebuli jest sulfotlenek S-metyl-L-cysteiny. Może on zmniejszać zawartość lipidów we krwi. Quercetin ma podobny efekt w zmniejszaniu produkcji i syntezy lipidów w doświadczeniach na zwierzętach. Lactobacillus może również obniżyć poziom cholesterolu we krwi. Wiele badań wykazało, że Lactobacillus może hamować readsorpcję kwasów żółciowych i przyłączanie cholesterolu do ściany komórkowej. Jednak ekstrakt z fermentowanej cebuli nie został jeszcze dobrze przebadany. Niewiele grup badawczych próbowało opracować produkt do picia zawierający fermentowany ekstrakt z cebuli.

W tym badaniu podjęliśmy próbę zidentyfikowania odpowiedniej bakterii do fermentacji cebuli i określenia jej wpływu na poziom lipidów we krwi. Nasze dane sugerują, że ekstrakt z fermentowanej cebuli ma wpływ na metabolizm lipidów po podaniu doustnym.

4. Wnioski

Główną substancją aktywną odpowiedzialną za działanie antyhiperlipidemiczne fermentowanej cebuli była kwercetyna. Uzyskane wyniki sugerują, że fermentowana cebula ma działanie prewencyjne/terapeutyczne w chorobie hiperlipidemicznej. It might have potential to be developed as a functional food.

Data Availability

The data are linked to online repositories of http://www.nodagi.net.

Conflicts of Interest

The authors declare that there are no conflicts of interest regarding the publication of this article.

Wkład Autorów

Woong-Suk Yang i Jin-Chul Kim w równym stopniu przyczynili się do powstania tej pracy.

Podziękowania

Badania te były częściowo wspierane przez Nodaji Co. Ltd., (Pohang, Korea) w roku 2012.

Podziękowania