Wskazania kliniczne

Niestabilność mikrosatelitarna (MSI) wynika z systematycznego gromadzenia się delecji/wstawek w krótkich powtarzających się sekwencjach DNA w komórkach nowotworowych z wadliwym systemem naprawy niedopasowania (MMR). MSI występuje w około 15% wszystkich raków jelita grubego i jest przydatny klinicznie do identyfikacji pacjentów z dziedzicznym niepolipowatym rakiem jelita grubego (HNPCC, zespół Lyncha) spowodowanym mutacjami germinalnymi genów MMR. Status MSI może również przewidywać odpowiedź/oporność nowotworu na niektóre chemioterapie.

W próbie standaryzacji analizy MSI, warsztaty National Cancer Institute (NCI) z 1997 roku zaleciły panel referencyjny pięciu markerów mikrosatelitarnych do wykrywania MSI i ustanowiły wytyczne klasyfikacji MSI w oparciu o wyniki. Panel referencyjny, określany jako panel Bethesda, składa się z dwóch loci mononukleotydowych (Big Adenine Tract lub BAT-25 i BAT-26) oraz trzech loci dinukleotydowych (D2S123, D5S346 i D17S250). Używając panelu Bethesda, raki z niestabilnością w 2 lub więcej z tych loci były interpretowane jako MSI-high (MSI-H), a raki bez niestabilności w żadnym z pięciu loci były uważane za Microsatellite Stable (MSS). Na kolejnych warsztatach NCI uznano, że czułość i swoistość oryginalnego panelu Bethesda może być ograniczona ze względu na włączenie powtórzeń dinukleotydowych, które są mniej czułe i swoiste niż powtórzenia mononukleotydowe w identyfikacji nowotworów z niedoborami MMR. Zasugerowano, że panel quasimonomorficznych powtórzeń mononukleotydowych może być wystarczająco czuły i specyficzny do wykrywania nowotworów o wysokim MSI i może eliminować potrzebę posiadania normalnego DNA pasującego do badanych guzów (1-8).

MSI Analysis System (zestaw tylko do użytku badawczego, wersja 1.2, Promega Corporation).

MSI Analysis System to multipleksowy, fluorescencyjny test oparty na PCR do wykrywania niestabilności mikrosatelitarnej. System MSI Analysis System zawiera fluorescencyjnie znakowane startery do koamplifikacji pięciu quasimonomorficznych markerów powtórzeń mononukleotydowych (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 i MONO-27). Produkty PCR rozdzielono metodą elektroforezy kapilarnej (CE) przy użyciu analizatora genetycznego Applied Biosystems 3500Dx Genetic Analyzer. Niestabilność mikrosatelitarna w 2 lub więcej loci mononukleotydowych jest interpretowana jako MSI-high; niestabilność mikrosatelitarna w pojedynczym locus mononukleotydowym lub brak niestabilności w którymkolwiek z badanych loci jest interpretowana jako stabilna mikrosatelitarnie (MSS). Zazwyczaj próbki o wysokim MSI wykazują niestabilność we wszystkich loci ze średnim spadkiem wielkości produktu od 5 do 9 zasad. Obecność MSI jest wykrywana ze swoistością analityczną co najmniej 99% i granicą wykrywalności co najmniej 5%.

Ważną cechą konstrukcyjną Systemu analizy MSI jest odstęp pomiędzy pięcioma różnymi loci, który generalnie przekracza typową liczbę przesuniętych zasad (średnio 5 do 9 zasad), gdy MSI jest obecny. Najdłuższy rozmiar amplikonu PCR wynosi 154 pary zasad, co jest korzystne w przypadku analizy tkanki utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie (FFPE).

Ten test jest standardem dla rutynowych badań MSI o wysokiej przepustowości, zwłaszcza gdy inne testy molekularne są wymagane dla tej samej próbki DNA.

Wymagania dotyczące próbek

Dopuszczalne próbki do badania to utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie próbki tkanki raka jelita grubego o czasie utrwalania 6-48 godzin.

Objętość

Preferowany jest 1 reprezentatywny blok parafinowy. Alternatywnie, dla próbek z resekcji wymagane jest minimum 5 niebarwionych wycinków tkanki (o grubości 5 µm).

Instrukcje dotyczące przechowywania i wysyłki

Przechowywać i wysyłać próbki w temperaturze otoczenia.

Ograniczenia

Niedostateczna zawartość guza może uniemożliwić wykrycie niestabilności MSI: wymagane jest 10% komórek guza. Zawartość guza jest oceniana przed analizą i wykonywana jest makrodysekcja. Środki utrwalające inne niż formalina lub przedłużony czas utrwalania mogą prowadzić do uzyskania nieodpowiednich wyników.

Wymagania specjalne

Brak.

Czas realizacji

Pięć do siedmiu dni roboczych odpowiednio dla szkiełek i bloczków parafinowych.

2. IdyllaTM MSI Assay (CE-IVD) – Akredytacja w toku

Test IdyllaTM MSI Assay (RUO) służy do wykrywania niestabilności mikrosatelitarnej bezpośrednio z utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) wycinków tkanki nowotworowej człowieka, wykorzystując reakcję PCR, po której następuje analiza krzywej topnienia o wysokiej rozdzielczości w urządzeniu IdyllaTM.

Test wykonuje wykrywanie mutacji w 7 monomorficznych homopolimerycznych loci do identyfikacji ludzkich nowotworów z niestabilnością mikrosatelitarną (ACVR2A, BTBD7, DIDO1, MRE11, RYR3, SEC31A i SULF2). Biomarkery te są specyficzne dla danego guza, wykazują wysoką częstość występowania w raku jelita grubego i endometrium oraz są stabilne w różnych grupach etnicznych. Ponadto, te specyficzne dla nowotworu biomarkery nie wymagają analizy sparowanych próbek tkanki prawidłowej.

Status MSI dla próbki jest określany na podstawie ostatecznego połączenia wszystkich 7 biomarkerów. Niestabilność mikrosatelitarna w 2 lub więcej loci mononukleotydowych jest interpretowana jako MSI-high; niestabilność mikrosatelitarna w pojedynczym locus mononukleotydowym lub brak niestabilności w którymkolwiek z badanych loci jest interpretowana jako stabilna mikrosatelitarnie (MSS).

Ten test pozwala na wykonywanie badań MSI z niską wydajnością i jest idealny do badań odruchowych lub ratunkowych w celu szybkiego uzyskania lub potwierdzenia dokładnego wyniku MSI.

Wymagania dotyczące próbek

Dopuszczalne próbki do badania to utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie próbki tkanki raka jelita grubego o czasie utrwalania 6-48 godzin.

Objętość

Preferowany jest 1 reprezentatywny blok parafinowy. Alternatywnie, dla próbek z resekcji wymagane są minimum 2 niebarwione wycinki tkanki (grubość 5 µm; 50-600 mm²).

Instrukcje dotyczące przechowywania i wysyłki

Przechowywać i wysyłać próbki w temperaturze otoczenia.

Ograniczenia

Niedostateczna zawartość guza może uniemożliwić wykrycie niestabilności MSI: wymagane jest 20% komórek guza. Zawartość guza jest oceniana przed analizą i wykonywana jest makrodysekcja. Środki utrwalające inne niż formalina lub przedłużony czas utrwalania mogą spowodować uzyskanie nieodpowiednich wyników.

Wymagania specjalne

Brak.

Czas realizacji

Trzy do pięciu dni roboczych odpowiednio dla szkiełek i bloczków parafinowych.

1. Umar A, Boland CR, Terdiman JP et al. Revised Bethesda Guidelines for Hereditary Nonpolyposis Colorectal cancer (Lynch Syndrome) and Microsatellite Instability. Journal of the National Cancer Institute 2004;96(4):261-268.
2. De la Chapelle A, Hampel H. Clinical Relevance of Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology 2010;28(20):3380-3387.
3. Bacher JW, Flanagan LA, Smalley RL et al. Development of a fluorescent multiplex assay for detection of MSI-High tumors. Disease Markers 2004; 20:237-250.
4. Murphy KM, Zhang S, Geiger T et al. Comparison of the Microsatellite Instability Analysis System and the Bethesda Panel for the Determination of Microsatellite Instability in Colorectal Cancers. Journal of Molecular Diagnostics 2006;8(3):305-311.
5. Anderson S, Bloom KJ, Vallera DU et al. Multisite Analytic Performance Studies of a Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of BRAF V600E Mutations in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Specimens of Malignant Melanoma. Arch pathol lab Med 2012;136(11):1385-1391.
6. Buhard O, Suraweera N, Lectard A et al. Quasimonomorphic mononucleotide repeats for high-level microsatellite instability analysis. Disease Markers 2004;20:251-257.
7. Patil DT, Bronner MP, Portier BP et al. A five-marker panel in a multiplex PCR accurately detects microsatellite instability-high colorectal tumors without control DNA. Diagn Mol Pathol 2012 Sep;21(3):127-33.
8. Berg KD, Glaser CL, Thompson RE et al. Detection of microsatellite instability by fluorescence mulitplex polymerase chain reaction. J Mol Diagn 2000, 2:20-28.
9. De Craene et al. Detection of microsatellite instability (MSI) in colorectal cancer samples with a novel set of highly sensitive markers by means of the IdyllaTM MSI Test prototype. Journal of Clinical Oncology 2018; 36:15.

Updated on 23 May 2019

.