Bufory octanu amonu mogą powodować różne problemy w laboratorium. Dwa powszechne problemy obejmują zaskakujące wzrosty ciśnienia wstecznego w HPLC-MS przy uruchamianiu urządzenia po nocnym przechowywaniu i trudności z czułością MS.
Wzrost ciśnienia wstecznego w urządzeniu podczas używania octanu amonu (i mrówczanu amonu) jest częstym problemem spotykanym na forach chromatograficznych, zwłaszcza gdy urządzenie stało przez noc lub przy kilku pierwszych przebiegach każdego dnia. Bufory wodne o wysokiej rozpuszczalności mogą powodować wiele problemów. Stają się one problematyczne w praktycznym użyciu, blokując kapilary, prekolumny i końcówki kolumn analitycznych.
Problemy te niezmiennie wynikają z niezrozumienia rozpuszczalności buforów w mieszanych organicznych mediach wodnych. Można to przezwyciężyć stosując dane przedstawione na Rysunku 1.
Rysunek 1: Rozpuszczalność pięciu buforów w mieszaninach z acetonitrylem. (Zaadaptowano za zgodą z Ref. 1)
Rysunek 1 wyraźnie pokazuje, że rozpuszczalność octanu amonu w mieszaninach binarnych zawierających powyżej 90% acetonitrylu jest coraz bardziej ograniczona w rozpuszczalności i całkowicie nierozpuszczalna w 100% acetonitrylu. Podczas gdy 20mM octan amonu stanowi granicę rozpuszczalności w 90% acetonitrylu, granica ta gwałtownie spada do 10mM octanu amonu (popularne stężenie buforowe używane w zastosowaniach LC-MS) w 95% mieszaninach acetonitrylowych. Przekroczenie tych limitów rozpuszczalności powoduje powstanie mętnej cieczy z powodu drobnego osadu octanu amonu w roztworze. Może on blokować kapilary i fryty kolumn, powodując wzrost ciśnienia wstecznego w układzie. Należy również zauważyć, że dane z rysunku 1 zostały uzyskane przy użyciu wysokiej jakości buforu – rozpuszczalność zmniejszy się, jeśli używane są odczynniki soli buforowych o niższej jakości (czystości). Unikać prób rozpuszczania octanu amonu w czystym acetonitrylu, nawet jeżeli do roztworu można następnie dodać wodę. Chociaż początkowo może się wydawać, że bufor jest rozpuszczalny, szybko wypadnie z roztworu (Rysunek 2).
Rysunek 2: Resztki octanu amonu powstałe podczas “rozpuszczania” octanu amonu w acetonitrylu, a następnie dodania wody w celu uzyskania wymaganego stosunku organicznego / wodnego eluentu (Fotografia dzięki uprzejmości dr. Paul Ferguson, Astra Zeneca, Wielka Brytania).
W typowym gradiencie HPLC z odwróconą fazą, być może nie jest to tak duży problem, chyba że oczywiście twój gradient przechodzi do >90% acetonitrylu. Istnieją jednak inne względy, takie jak względne udziały procentowe rozpuszczalnika organicznego, które bufor wodny może napotkać podczas mieszania przy użyciu nisko- lub wysokociśnieniowych systemów mieszania, podczas wstrzykiwania próbek rozpuszczonych w wysokich udziałach procentowych acetonitrylu lub, w najgorszym ze wszystkich przypadków, gdy systemy są przepłukiwane 100% acetonitrylem w celu usunięcia zanieczyszczeń z kolumny lub do przechowywania przez noc.
W przypadku stosowania 100% acetonitrylu do przechowywania kolumn należy wziąć pod uwagę, że w 100% rozpuszczalniku organicznym mogą wystąpić duże zmiany pH i należy mieć na uwadze, czy te zmiany pH mogą spowodować, że pH przechowywania kolumny wejdzie w zakres, w którym możliwe będzie rozpuszczenie matrycy krzemionkowej, co doprowadzi do tworzenia się “drobin” w kolumnie, co ostatecznie spowoduje zablokowanie kolumny (przy wysokim pH) lub usunięcie ligandów fazy związanej (przy niskim pH).
Octan amonu jako bufor
Wiele osób zdecydowało się na użycie octanu amonu jako buforu, zwłaszcza w przypadku stosowania detekcji MS, ze względu na jego nieodłączną lotność i niską skłonność do zanieczyszczenia źródła API. Należy jednak pamiętać o tej ograniczonej rozpuszczalności i odpowiednio dostosować naszą praktykę HPLC. Zrozum, czy użycie octanu amonu jest odpowiednie dla danego eksperymentu i czy bufor jest rzeczywiście konieczny. Wymagania dotyczące użycia i odpowiedniego wyboru i stężenia buforu są powszechnie niezrozumiałe. Octan amonu jest przykładem do zbadania zastosowań i nadużyć tego bardzo lubianego systemu buforowego.
Bufory są wymagane, aby oprzeć się niewielkim zmianom pH (głównie eluentu) i zapewnić, że kolumna HPLC pozostaje w stanie stałego ładunku (głównie stan jonizacji resztkowych form silanolu na powierzchni podpory krzemionkowej). Zmiany pH mogą powodować problemy ze stabilnością czasu retencji, kształtem pików oraz (w przypadku stosowania systemu Electrospray MS) czułością urządzenia. Zazwyczaj największe “wyzwanie” dla pH systemu pochodzi z mieszania rozcieńczalnika próbki z eluentem w elementach łączących pomiędzy iniektorem a kolumną HPLC (lub przedkolumną) oraz na czole kolumny. Jeżeli rozcieńczalnik próbki ma inne pH, wówczas analit (lub część cząsteczek analitu) może zmienić stan jonizacji i w rezultacie inaczej chromatografować lub inaczej reagować w interfejsie MS. Jednak zrozumienie chemii naszej metody analitycznej w celu dokonania krytycznych wyborów dotyczących rodzaju i stężenia buforu jest ważne. Stężenia analitów i ilość powierzchni kolumny wymagającej kontroli pH są na tyle niskie, że potrzebne jest tylko bardzo niskie stężenie buforu, aby utrzymać odtwarzalne czasy retencji, akceptowalny kształt piku i czułość wykrywania.
Rysunek 3 wskazuje sytuacje, w których octan amonu może być przydatny zarówno w chromatografii, jak i spektrometrii mas.
Rysunek 3: Zmienność pojemności buforowej dla wodnego roztworu octanu amonu (10mM) z różnymi proporcjami acetonitrylu (%) (Zaadaptowano za zgodą z Ref. 2)
Podsumowując, istnieją dwa regiony buforowania, gdy 10mM octan amonu jest dodany do naszego roztworu eluentu i albo rozcieńczony amoniak lub kwas mrówkowy są używane do dostosowania pH. Bez dodatku kwasu lub zasady, roztwór będzie miał bardzo małą zdolność buforowania.
W 100% roztworze wodnym, wartości pKa buforu są około 4,8 i 9,5. Bufor jest najlepiej stosowany około +/- 1 jednostki pH od pKa buforu, gdzie zdolność buforowania zostanie zmniejszona do około 66%. Przy 2 jednostkach pH od pKa buforu, pojemność buforu jest zmniejszona do około 5%. Dla buforu octanu amonu w wodzie, pH eluentu używanego do rozdzielania powinno wynosić 3,8 do 5,8, gdy używany jest kwas mrówkowy jako modyfikator pH i 8,5 do 10,5, gdy amoniak jest używany do dostosowania pH eluentu. Zastrzeżenie: po dodaniu acetonitrylu do systemu ten zakres roboczy zmienia się i użyteczny zakres pH staje się od 5,2 do 7,2 lub od 7,9 do 9,9 przy 60% acetonitrylu. W przypadku rozdzielania gradientowego, pKa układu buforowego będzie się stale zmieniać. PKa systemu przy wyjściowym składzie gradientu jest używane do oszacowania przydatności buforu do rozdziału.
Czy te zakresy pH będą wystarczające, aby uniknąć zmian w zakresie jonizacji analitu lub zmian protonowania kolumny? To jest kluczowe pytanie.
Dla wykrywania MS, jonogenne anality w formie zjonizowanej spowoduje dobrą czułość wykrywania, podczas gdy zarządzanie retencją fazy odwróconej poprzez rozsądny wybór fazy stacjonarnej i rozpuszczalnika organicznego typu i składu. Jeżeli analit jest w pełni zjonizowany przy zakresach pH zasugerowanych powyżej (i na rysunku 3), wówczas uzyskana zostanie dobra wydajność chromatograficzna i wykrywania. Należy zauważyć na rysunku 1, że pojemność buforowa systemu zmniejsza się w miarę dodawania acetonitrylu, przy czym pojemność buforowa spada do 30% wartości wodnej przy 60% acetonitrylu. Kluczową zasadą przy stosowaniu buforu w LC-MS jest użycie jak najmniejszej ilości buforu, aby utrzymać odtwarzalność czasu retencji, akceptowalny kształt piku i czułość detektora. Stężenie buforu będzie miało bezpośredni wpływ na ilość napotkanego tłumienia jonów i dlatego będzie miało bezpośredni wpływ na czułość metody. Aby utrzymać dobrą zdolność buforowania przy niższych stężeniach buforu, często dążymy do pracy w zakresie +/- 0,5 jednostki pKa buforu.
Tabela 1 pokazuje zalecane zakresy pH, w których bufory octanu amonu będą przydatne.
| % MeCN | Maksymalny zakres pojemności buforowej (kwas octowy / octan) | Maksymalny zakres pojemności buforowej (amon / amoniak) | Pojemność buforowa (% w stosunku do 100% roztworu Aq) |
| 0 | 4.2 – 5.2 | 9.0 – 10.0 | 100 |
| 20 | 4.7 – 5.7 | 8.7 – 9.7 | 80 |
| 40 | 5.0 – 6.0 | 8.5 – 9.5 | 50 |
| 60 | 5.6 – 6.6 | 8.3 – 9.3 | 30 |
Tabela 1: Zalecane zakresy robocze pH i orientacyjne względne pojemności buforowe dla systemów eluentów 0,1mM octan amonu (aq) / acetonitryl.
Użyj zakresów buforowania z Tabeli 1, aby wybrać pH eluentu, w którym analit powinien być w 100% zjonizowany. Należy zauważyć, że stężenie buforu użyte do wyprowadzenia tych liczb to 0,1 mM – popularny wybór stężenia buforu przy stosowaniu detekcji MS. Dla podstawowych analitów powszechny jest system buforowania kwas octowy/octan, a pH eluentu jest zwykle znacznie poniżej pKa podstawowych analitów, zapewniając, że są one stale protonowane. To samo może być prawdziwe dla kwaśnych analitów z systemem amonowym/amoniakalnym, gdzie kwaśne anality powinny być w pełni zdeprotonowane. Zapewni to, że czasy retencji są stałe, kształty pików są zdrowe, a czułość MS jest zoptymalizowana z perspektywy chemii metody.
Istnieją duże luki w efektywnych zakresach buforowania dla eluentów opartych na octanie amonu. To znaczy, przy 20% składzie eluentu acetrontrylu (lub wyjściowym składzie gradientu 20% acetonitrylu), prawdopodobnie będzie niższa zdolność buforowania (wyższe stężenia buforu będą musiały być użyte) z pH eluentu poniżej 4,2, między pH 5,2 i 9,0 lub powyżej 10,0. Istnieją inne metody, w których pH eluentu jest dostosowane poza tymi zalecanymi zakresami przy użyciu buforów octanu amonu. Rozważ użycie innego systemu buforowego – system mrówczany/kwas mrówkowy jest popularnym wyborem przy wartościach pH eluentu poniżej 4,2.
Should A Buffer Always Be Used?
If the eluent pH is far from the pKa of the analyte, small changes in eluent pH will have a negligible effect on the degree of analyte ionisation. W tych okolicznościach stosowanie buforu może być zbędne. Na przykład, kwasy octowy (jak również mrówkowy, trifluorooctowy i difluorooctowy) mają znaczną zdolność “samobuforowania” przy niskim pH i zapewniają podstawowemu analitowi pKa >2 jednostki pH wyżej i kwaśnemu analitowi pKa
To wszystko przy założeniu, że podstawowe anality są analizowane przy użyciu kwaśnego systemu eluentu, a kwaśne anality przy bardziej zasadowym pH systemu eluentu, aby zapewnić pełną jonizację i dobrą czułość elektrospray MS. Jeżeli występują problemy z ciśnieniem wstecznym urządzenia, niestabilnością czasu retencji lub czułością wykrywania MS, wówczas warto rozważyć, czy sól buforowa jest w ogóle potrzebna. Rozsądne użycie kwasów mrówkowego lub octowego lub roztworu amoniaku może rozwiązać wszelkie problemy.
Cokolwiek to jest, należy poświęcić czas na zrozumienie chemii metody w odniesieniu do pKa analitu, wymaganego pH eluentu i wyboru systemu buforowania używanego do osiągnięcia i utrzymania tego pH w systemie.
Dla tych, którzy nie mają informacji o pKa analitu, istnieje wiele darmowych programów, które wykonują rozsądną pracę przewidywania pKa analitu w oparciu o strukturę. Szeroko stosowane w naszych laboratoriach to:
- ChemSketch – https://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch/
- MarvinSketch – https://chemaxon.com/products/marvin
Jeśli szukasz głębszego zrozumienia buforów i ich zastosowania w HPLC i LC-MS, zapoznaj się z artykułami w referencjach 3-6.
Solubility of Buffers in Aqueous-Organic Eluents for Reversed-Phase Liquid Chromatography, Adam P. Schellinger and Peter W. Carr, LCGC North America Volume 22 Number 6 June 2004
Buffer Considerations for LC and LC-MS, Xavier Subirats, Elisabeth Bosch, and Marti Rosés, LCGC North America Volume 27 Number 11 November 2009
Mobile-Phase Buffers, Part I – The Interpretation of pH in Partially Aqueous Mobile Phases, LCGC North America Volume 20 Number 11 November 2002
Mobile-Phase Buffers, Part II – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 20 Number 12 December 2002
Mobile-Phase Buffers, Part III – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 21 Number 1 January 2003
Bufory fazy ruchomej w LC: Effect of Buffer Preparation Method on Retention Repeatability, LCGC North America Volume 37, Issue 7, July 2019