2.25.2.3.2(iv) Wspólne cele w różnych typach komórek mózgu

Homeostaza wapnia i zależna od wapnia kinaza sygnalizacji komórkowej są najczęstszymi celami ołowiu we wszystkich typach komórek mózgu. Chociaż dwuwartościowe jony wapnia (Ca2+) i dwuwartościowe jony ołowiu (Pb2+) mają różne właściwości chemiczne, gdzie jony wapnia sprzyjają wiązaniu tlenu i jony ołowiu preferują wiązanie siarki, skutki ołowiu na homeostazę wapnia i sygnalizację komórkową zależną od wapnia zostały preferencyjnie skupione w historii toksyczności ołowiu (np. osteoporoza w zatruciu ołowiem i szlaki sygnalizacyjne kinazy białkowej C (PKC)) (Goldstein 1993; Pounds et al. 1991). Zidentyfikowanie ołowiu silnie związanego z GRP78, białkiem ubogim w cysteinę (Qian i wsp. 2000), sugeruje, że ołów może również oddziaływać z białkami bogatymi w niesulfhydryl. GRP78 to bogate w kwas glutaminowy i asparaginowy białko wiążące wapń (17,2% kwasu glutaminowego i asparaginowego w porównaniu do średniej 11,7%) (Klapper 1977), które znajduje się w ER i przyczynia się do buforowania wapnia w ER, głównej organelli magazynującej wapń (Macer i Koch 1988). Ołów wiążąc się z GRP78 dalej dostarcza silnych dowodów na poparcie głównej roli ołowiu zaburzonej homeostazy wapnia i zależnej od wapnia sygnalizacji komórkowej w neurotoksyczności ołowiu.

Znaczenie wapnia w sygnalizacji komórkowej jest dobrze znane. Wapń odgrywa znaczącą rolę w różnicowaniu neuronów, wzroście, rozgałęzieniach, migracji, organizacji strukturalnej, tworzeniu synaps i plastyczności synaptycznej (Braun i Schulman 1995). Znaczenie sygnalizacji wapniowej jest również udokumentowane w komunikacji pomiędzy astroglejami oraz pomiędzy astroglejami i neuronami (Scemes i Giaume 2006). Bezpośrednio lub pośrednio zależne od wapnia białka i enzymy są zaangażowane w wiele szlaków sygnalizacji komórkowej, a homeostaza wapnia jest również zaangażowana w apoptozę układu nerwowego (Alberdi i wsp. 2005; Polster i Fiskum 2004). Sygnalizacja komórkowa zależna od wapnia jest regulowana przez zmiany wewnątrzkomórkowego stężenia wolnych jonów wapnia poprzez kanały wapniowe (np. kanały wapniowe zależne od napięcia (VGCCs)) lub pompy (np. pompa Ca2+-ATPazy) w błonie plazmatycznej lub magazynach wewnątrzkomórkowych (np. ER i mitochondria). Z drugiej strony, cykle fosforylacji/deposforylacji kanałów wapniowych (np. kanałów VGCC i kanałów receptora NMDA) regulowane przez kinazy/fosfatazy zależne od wapnia również regulują wewnątrzkomórkowe stężenia wapnia (Lieberman i Mody 1994; Raman i wsp. 1996). Tak więc substancje neurotoksyczne, w tym ołów, mogą wpływać na homeostazę wapniową na wiele sposobów, co będzie skutkować zmianami w sygnalizacji komórkowej. Temat ten został szczegółowo omówiony (Audesirk i Tjalkens 2004), dlatego w tej części skupimy się na wspólnych celach białek lub enzymów zależnych od wapnia oraz innych potencjalnych wspólnych celach.

PKC jest kinazą białkową pośredniczącą w przekazywaniu wapnia, zaangażowaną w sygnalizację komórkową we wszystkich typach komórek mózgu (Braun i Schulman 1995). Ołów stymuluje zależną od wapnia i fosfolipidów PKC aktywowaną diacyloglicerolem, częściowo oczyszczoną z mózgu szczura, a pikomolarne stężenia ołowiu okazały się równoważne mikromolarnym stężeniom wapnia w aktywacji PKC (Long et al. 1994; Markovac i Goldstein 1988). Tak więc ten enzym regulacyjny może wyczuwać poziomy ołowiu oczekiwane przy obecnym niskim poziomie narażenia środowiskowego. Chociaż większość ołowiu znajdującego się w mózgu odkłada się w astrogliach, możliwe jest, że wystarczająca ilość ołowiu może dotrzeć do neuronów i innych typów komórek mózgu, aby modulować aktywność PKC. Badania z komórek PC12 wykazały, że poziom ołowiu tak niski jak 10 nmol l-1 zwiększał aktywność PKC, podczas gdy poziom większy lub równy 10 μmol l-1 zmniejszał aktywność PKC. Obecność glutaminianu w stężeniu 500 μmol l-1 nasilała indukowaną ołowiem śmierć komórek, która mogła być częściowo zablokowana przez 100 nmol l-1 staurosporyny, inhibitora PKC, lub 1 μmol l-1 MK-801, antagonisty NMDA (Jadhav i wsp. 2000). Podobne wyniki uzyskano również w innych badaniach, w których wykazano, że ołów w stężeniu 0,53 μmol l-1 zwiększał aktywność PKC o 200% po 2 h, a następnie aktywność ta powracała do poziomu kontrolnego po 48 h (Tian i wsp. 2000). Znaczenie aktywności PKC aktywowanej przez ołów zostało powiązane z różnicowaniem neuronów. Badania z hodowanych szczurzych neuronów hipokampa wykazały, że hamowanie PKC za pomocą kalfostyny C nasilało hamowanie inicjacji neurytów wywołane przez 100 nmol l-1 chlorku ołowiu (Kern i Audesirk 1995), co sugeruje udział PKC w neurotoksyczności ołowiu. W przeciwieństwie do tego badania, ołów w stężeniu 25-100 nmol l-1 stymulował wzrost neurytów indukowany NGF w komórkach PC12, a aktywacja kinazy białkowej regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) była zaangażowana w stymulację ołowiem (Crumpton i wsp. 2001; Williams i wsp. 2000a). Tak więc, te przeciwstawne wyniki odzwierciedlają złożoność wynikającą z obecności wielu szlaków inicjacji neurytów i wielu celów zatrucia ołowiem w układzie nerwowym. Hydroksylaza tyrozynowa (TH) jest markerem rozwojowym różnicowania neuronów, a jej aktywność jest regulowana przez PKC. Inhibitor PKC Ro32-0342 hamował indukowaną ołowiem aktywność TH w komórkach PC12 (Tian i wsp. 2000). ODC jest kluczowym enzymem regulacyjnym szlaku poliaminowego, zaangażowanym w liczne procesy metaboliczne w rozwijającym się i dojrzałym układzie nerwowym. W neocortex i móżdżku szczurzych szczeniąt narażonych laktacyjnie na ołów poprzez wodę pitną matki (0,2% octan ołowiu) od urodzenia do odsadzenia, ekspozycja na ołów osłabiła zarówno aktywność ODC jak i PKC w PND 3 do PND 30. Badania na komórkach PC12 sugerują, że osłabienie ODC przez ołów było spowodowane osłabioną przez ołów aktywnością PKC, ponieważ aktywność ODC indukowana NGF była osłabiona przez inhibitor PKC – staurosporynę (Hilliard i wsp. 1999). Aktywność PKC była również zaangażowana w indukowaną ołowiem aktywność wiązania DNA czynnika transkrypcyjnego Sp1, ponieważ inhibitor PKC staurosporyna zmniejszała indukowane ołowiem wiązanie DNA Sp1 w komórkach PC12, co zostało poparte odkryciem, że aktywność wiązania DNA Sp1 była modulowana równolegle z aktywnością PKC w hipokampie szczurów eksponowanych na ołów (Atkins i wsp. 2003). Uważa się, że Sp1 jest również zaangażowany w ekspresję genów receptora NMDA (Bai i Kusiak 1995). PKC-dependent Sp1 DNA binding should play an important role in lead-modulated NMDA receptor expression even though controversial results have been reported from different research groups (Cory-Slechta et al. 1997a,b; Guilarte et al. 1993; Lasley et al. 2001; Ma et al. 1997).

Studies have revealed that PKC activation was involved in lead-induced delay of oligodendrogliogenesis. Indukowane ołowiem zmniejszenie proliferacji i różnicowania w hodowlanych OP szczurów było zniesione przez zahamowanie PKC bisindolilomaleimidem I, podczas gdy efekt czynnika aktywującego PKC – forbolu-12,13-didekanianu był potęgowany przez ołów. Ołów powodował również translokację PKC z cytoplazmy do przedziału błonowego bez wzrostu całkowitej aktywności PKC w komórce (Deng i Poretz 2002). Sp1 może regulować ekspresję genów MBP i PLP, dwóch głównych składników strukturalnych mieliny centralnego układu nerwowego (Henson i wsp. 1992; Tretiakova i wsp. 1999). Tak więc, PKC-zależna aktywność Sp1 wiążąca DNA jest racjonalnie przypuszczalna w indukowanych ołowiem zmianach profili rozwojowych PLP i MBP (Zawia i Harry 1995).

Ale żadne bezpośrednie dowody nie wykazały, że PKC-zależna aktywność Sp1 wiążąca DNA była zaangażowana w ekspresję genów HSP70, HSP90 i GRP78 regulowaną przez ołów w zwojach nerwowych (Opanashuk i Finkelstein 1995; Qian i in. 2000, 2001; Selvin-Testa et al. 1997), udział Sp1 i PKC w ekspresji genów HSP70, HSP90 i GRP78 (Jacquier-Sarlin et al. 1995; Rebbe et al. 1989; Song et al. 2001; Ting i Lee 1988) sugeruje, że ołów może modulować ekspresję tych genów poprzez zależną od PKC regulację wiązania DNA przez Sp1. Korelacja między ekspresją PKC i GFAP była profilowana w astroglejowych liniach komórkowych (Brodie i wsp. 1998; Masliah i wsp. 1991). Nadal jednak nie wiadomo, czy w indukowanej ołowiem nadekspresji GFAP pośredniczy PKC (Harry i wsp. 1996; Selvin-Testa i wsp. 1994; Stoltenburg-Didinger i wsp. 1996; Waterman i wsp. 1994). Badania na ludziach zatrudnionych przy produkcji ołowiu potwierdzają znaczenie modulowanej przez ołów aktywności PKC w neurotoksyczności ołowiu, ponieważ ołów w kości piszczelowej i czas trwania ekspozycji były znacząco związane z aktywacją PKC w erytrocytach (Hwang i wsp. 2001). Podsumowując, PKC prawdopodobnie pośredniczy w wielu aspektach neurotoksyczności indukowanej ołowiem w układzie nerwowym.

Dehydrataza kwasu δ-aminolewulinowego (ALAD) jest kluczowym enzymem, który katalizuje konwersję kwasu δ-aminolewulinowego (δ-ALA) w porfobilinogen w szlaku biosyntezy hemu. ALAD jest dobrze znanym celem molekularnym ekspozycji na ołów, a jego aktywność jest hamowana o 50%, gdy poziom ołowiu we krwi przekracza 20 μg dl-1. Indukowana ołowiem inhibicja ALAD skutkuje zwiększonym poziomem krążącego ALA. Dlatego aktywność ALAD we krwi i poziom δ-ALA w moczu są wykorzystywane do diagnozowania zatrucia ołowiem u dorosłych z poziomem ołowiu we krwi przekraczającym 35 μg dl-1 i u dzieci z poziomem 25-75 μg dl-1. Ponadto, podwyższony poziom krążącego ALA zmniejsza uwalnianie GABA w ośrodkowym układzie nerwowym, powodując neurotoksyczność ołowiu (Patrick 2006b). Chociaż hamowanie ALAD przez ekspozycję na ołów jest identyfikowane w erytrocytach, ALAD ulega ekspresji we wszystkich tkankach, w tym w tkankach mózgowych, a hem jest niezbędny do biosyntezy cytochromów wymaganych do produkcji ATP w mitochondriach. Dodatkowo, motyw wiążący cynk CysCysHisCys w ALAD ma znacznie wyższe powinowactwo do ołowiu z aktywnością absorpcji molowej 16 000 mol-1 cm-1, znacznie wyższe niż najbardziej powszechny motyw palca cynkowego, CysCysHisHis, z aktywnością absorpcji molowej 700 mol-1 cm-1 w innych białkach lub enzymach (Godwin 2001). Można zatem oczekiwać, że ołów hamuje aktywność ALAD w tkankach mózgu, prowadząc do neurotoksyczności w ośrodkowym układzie nerwowym.

.