Abstract

Oceniono wpływ cynku, magnezu i wapnia w osoczu nasienia na czas do zajścia w ciążę (TTP) u zdrowych par, na konwencjonalne parametry nasienia oraz parametry analizy nasienia wspomaganej komputerowo (CASA). Lokalizację chelatowalnych jonów cynku w osoczu nasienia i plemnikach oceniano metodą autometalografii (AMG). Oceniono różnice w lokalizacji cynku chelatowalnego w próbkach o wysokiej i niskiej zawartości cynku całkowitego. Próbki nasienia od 25 par z krótkim TTP i 25 par z długim TTP poddano konwencjonalnej analizie nasienia, CASA, pomiarom cynku i magnezu metodą spektrometrii mas w plazmie indukcyjnie sprzężonej oraz wapnia metodą płomieniowej absorpcyjnej spektrometrii atomowej. Stwierdzono silną korelację między tymi kationami, natomiast nie wykazano korelacji z TTP i konwencjonalnymi parametrami nasienia. Próbki nasienia o wysokim stężeniu cynku wykazywały statystycznie istotnie gorszą ruchliwość ocenianą parametrami CASA: prędkością prostoliniową i liniowością niż próbki o niskiej zawartości cynku. Stężenie wapnia również wykazało statystycznie istotne różnice dla tych samych parametrów, ale efekt ten został usunięty poprzez wprowadzenie stężenia cynku do modelu regresji wielokrotnej. Próbki nasienia o wysokiej całkowitej zawartości cynku wykazywały silniejsze zabarwienie plazmy nasienia w AMG. Sugeruje się, że wysokie stężenia cynku w nasieniu mają tłumiący wpływ na ruchliwość postępową plemników (`jakość ruchu’), ale nie na odsetek ruchliwych plemników (`ilość ruchu’).

Wprowadzenie

Całkowita zawartość cynku w nasieniu ssaków jest wysoka, a cynk okazał się być krytyczny dla spermatogenezy. Niedobór cynku jest związany z hipogonadyzmem i niewystarczającym rozwojem drugorzędowych cech płciowych u ludzi (Prasad, 1991) i może powodować atrofię kanalików nasiennych u szczura, a tym samym niepowodzenie spermatogenezy (Millar i inni, 1958; Underwood, 1977; Endre i inni, 1990). Stwierdzono, że wysokie stężenia cynku obniżają pobór tlenu w komórce plemnika (Huacuja i in., 1973; Foresta i in., 1990) oraz reakcję akrosomalną wywołaną przez albuminy (Foresta i in., 1990). Cynk w nasieniu ma również wpływ na przyłączanie/odłączanie główki-ogonka oraz kondensację/dekondensację chromatyny jądrowej (Kvist, 1980; Bjorndahl i Kvist, 1982). Istnieją sprzeczne doniesienia na temat wpływu cynku w nasieniu na ruchliwość plemników (Stankovic i Mikac-Devic, 1976; Danscher i in., 1978; Caldamone i in., 1979; Lewis-Jones i in., 1996). Wykazano, że chelatowanie jonów cynku wpływa na ruchliwość plemników (Saito i in., 1967; Danscher i Rebbe, 1974) i sugerowano, że miarą wpływu cynku na funkcję plemników powinien być raczej biodostępny cynk związany z białkami pęcherzykowymi o dużej masie cząsteczkowej niż całkowity cynk w nasieniu (Bjorndahl i in., 1991; Carpino i in., 1998).

Niniejsze badanie koncentruje się przede wszystkim na cynku. Oceniono związek cynku w nasieniu oraz, w pewnym stopniu, magnezu i wapnia z czasem do zajścia w ciążę (TTP) u zdrowych par. Ponadto oceniono korelację tych dwuwartościowych kationów z konwencjonalnymi parametrami nasienia i parametrami komputerowej analizy nasienia (CASA).

Autometalografia (AMGZn) jest histochemiczną metodą wykrywania jonów cynku i luźno związanych jonów cynku (cynk chelatowalny) w tkankach. Zbadano różnice w lokalizacji jonów cynku na poziomie mikroskopu świetlnego i mikroskopu elektronowego w plemnikach i osoczu nasienia od mężczyzn z wysokim całkowitym cynkiem i niskim całkowitym cynkiem.

Materiały i metody

Populacja badana

W sumie 430 par zostało zrekrutowanych wśród 52 255 członków czterech związków zawodowych. Próbki nasienia uzyskano od 430 par, ruchliwość oceniono manualnie i za pomocą CASA (patrz dalej), a próbki przechowywano w stanie zamrożonym (-20°C) do czasu dalszej analizy. Pary bez wcześniejszych doświadczeń reprodukcyjnych zostały zarejestrowane, gdy zaprzestały antykoncepcji i były śledzone przez co najmniej sześć pełnych cykli miesiączkowych lub do momentu rozpoznania ciąży . Spośród 430 par, 50 par, które zaszły w ciążę, zostało wybranych do obecnego badania: 25 par z najkrótszym TTP (S-TTP, mediana 1 miesiąc, zakres 1-2 miesięcy) i 25 par z najdłuższym TTP (L-TTP, mediana 10 miesięcy, zakres 7-28 miesięcy). Próbki nasienia od tych 50 par poddano poniższym analizom.

Konwencjonalna charakterystyka nasienia

Próbki nasienia uzyskano w wyniku masturbacji do 50 ml jałowych słoików styropianowych po zalecanych 3 dniach abstynencji. Po upłynnieniu próbki analizowano w temperaturze pokojowej zgodnie z kryteriami Światowej Organizacji Zdrowia (1992).

Objętość mierzono w szklanej probówce Falcon o pojemności 10 ml z podziałką (dokładność 0,1 ml). Ręczną ocenę ruchliwości plemników przeprowadzono w komorze liczącej Makler (Sefi Medical Instruments, Haifa, Izrael). Każdy napotkany plemnik był oceniany w następujący sposób: a: szybka ruchliwość postępowa, b: wolna lub powolna ruchliwość postępowa, c: ruchliwość nieprogresywna, d: immotility. Wykonywano co najmniej 2×100 punktów. Jeżeli różnica pomiędzy dwoma kolejnymi wyliczeniami przekraczała 10%, wykonywano dwa nowe wyliczenia. Odsetek ruchliwych plemników definiowano jako grupy `a + b + c’. Koncentrację mierzono w komorze liczenia Maklera, a morfologię klasyfikowano zgodnie z “surowymi” kryteriami Tygerberga opisanymi przez Krugera et al. (1986) na wysuszonych na powietrzu rozmazach utrwalonych w etanolu i eterze, barwionych techniką Papanicolaou (Światowa Organizacja Zdrowia, 1992). Oceny morfologii dokonywał jeden wyszkolony technik laboratoryjny. Żywotność plemników określano na rozmazach barwionych eozyną-negrozyną.

Komputerowo wspomagana analiza nasienia

Materiał do CASA uzyskiwano w następujący sposób: 4,5 μl świeżych, dobrze wymieszanych plemników przenoszono za pomocą pipety do komory liczącej Maklera o głębokości 10 μm. Próbkę umieszczano w mikroskopie fazowo-kontrastowym Olympus BH-2 (Olympus Denmark A/S, Glostrup, Dania) z płytką grzejną (37°C) przy powiększeniu ×200. Kamera wideo Sony DXC-107 (Sony Corp., Tokio, Japonia) przenosiła obrazy na kolorowy monitor wideo Sony PVM-1440QM (Sony Corp., Tokio, Japonia). Nagrania obrazów były dokonywane na kasecie wideo JVC HR-D560EG/E (JVC Victor Company of Japan, Tokio, Japonia). Nagrania były następnie analizowane na urządzeniu Hobson Sperm Tracker (Hobson Tracking Systems Ltd, Sheffield, UK) przy częstotliwości akwizycji 25 Hz, czasie śledzenia 2 s (łącznie 50 klatek), polu widzenia 300×300 μm (umożliwiającym wykrycie wszystkich wartości prędkości w linii prostej do 150 μm/s). Analizowano 100 plemników na próbkę.

Na podstawie analiz uzyskano następujące parametry: prędkość krzywoliniową (VCL), prędkość prostoliniową (VSL), liniowość (LIN), średnią prędkość ścieżki (VAP) i amplitudę przemieszczenia główki bocznej (ALH).

Oznaczenie cynku, magnezu i wapnia w nasieniu

Cynk, magnez i wapń w nasieniu mierzono we wszystkich 50 próbkach. Stężenie cynku i magnezu w nasieniu oznaczono metodą spektrometrii mas w plazmie indukcyjnie sprzężonej (ICP-MS). Aparatem był PQ2+ firmy Fisons Elemental (Winsford, Cheshire, UK). Podzielną część 20 μl rozcieńczono 100-krotnie roztworem zawierającym 5 g/l 25% amoniaku (ARISTAR; Merck, Poole, UK), 0,5 g/l EDTA (Janssen Chimica, Geel, Belgia) i 0,5 g/l Triton X-100 (Sigma, St Louis, MO, USA) w wodzie 18 MW Millipore. Jako wzorzec wewnętrzny dodano skand (AccuStandard, New Haven, CT, USA) do końcowego stężenia 100 μg/l. Wszystkie próbki były przygotowywane w dwóch egzemplarzach. Kalibracja została przeprowadzona przy użyciu ślepych próbek, do których dodano cynk i magnez (AccuStandard) do końcowych stężeń 1, 2 i 3 mg/l, odpowiadających stężeniom 100, 200 i 300 mg/l w oryginalnych próbkach nasienia. Analiza ta została przeprowadzona w trybie przeskoku piku z pomiarami przy 24Mg, 66Zn i 45Sc.

Oznaczenie wapnia zostało wykonane w tych samych preparatach przy użyciu płomieniowej atomowej spektrometrii absorpcyjnej (FAAS). Aparatem był Perkin-Elmer 306 (Norwalk, CT, USA). Kalibracja została przeprowadzona dla stężeń odpowiadających 100, 200 i 400 mg/l w oryginalnych próbkach nasienia. Próbki o wysokich stężeniach wapnia były rozcieńczane trzykrotnie, aby mieściły się w krzywej kalibracji.

Limity wykrywania, obliczone jako trzykrotność odchylenia standardowego dla 10 ślepych próbek przygotowanych przy tej samej okazji co próbki, wynosiły 1 mg/l dla cynku, 3 mg/l dla magnezu i 2 mg/l dla wapnia (wyrażone jako stężenia w nierozcieńczonych próbkach nasienia). Ogólne współczynniki zmienności w oznaczeniach, obliczone na podstawie wyników podwójnych analiz, wynosiły 18% dla cynku, 32% dla magnezu i 17% dla wapnia.

Przygotowano również preparaty do oznaczania cynku metodą płomieniowej absorpcyjnej spektrometrii atomowej (FAAS) w dziesięciu próbkach. Analiza regresji liniowej wyników ICP-MS i FAAS dała nachylenie 0,79 (95% przedział ufności: 0,58-1,00), punkt przecięcia 13 μg/l i r2 0,90. Nieco wyższe wyniki dla analiz ICP-MS nie były więc statystycznie istotne.

Autometalograficzne (AMG) opracowanie rozmazów nasienia do analizy mikroskopowej

Pięć próbek o wysokiej (242-308 mg/l) i 5 o niskiej (38-57 mg/l) zawartości cynku oznaczonej metodą ICP-MS inkubowano w 0,5% siarczku sodu (Bie & Berntsen) przez 30 min w celu utworzenia kratek siarczku cynku. Wymazy z roztworu ejakulatu/siarczku były wykonywane na szkiełkach szklanych płukanych w Farmerze. Wymazy wysuszono na powietrzu, utrwalono w 3% aldehydzie glutarowym (Bie & Berntsen) na 30 min i umieszczono w 0,1 M buforze fosforanowym na 3×2 min i raz w wodzie destylowanej na 2 min.

Wymazy zostały następnie wywołane metodą AMG w celu wzmocnienia srebrem siatek siarczku cynku. Wywoływacz składał się z 60 ml przefiltrowanego roztworu gumy arabskiej (1 kg rozpuszczony w 2 l wody destylowanej; Bidinger A/S, Aarhus, Dania), 10 ml buforu cytrynianu sodu i 0,85 g hydrochinonu (Merck, Darmstadt, Niemcy) rozpuszczonego w 15 ml ciepłej wody destylowanej. Bezpośrednio przed użyciem dodano 0,11 g mleczanu srebra (Fluka, Buchs, Szwajcaria) w 15 ml wody destylowanej i roztwór dokładnie wymieszano.

Opłukane przez rolnika słoiki zawierające rozmazy nasienia umieszczono w łaźni wodnej o temperaturze 26°C i przeniesiono do światłoszczelnego pudełka. Nowo przygotowany wywoływacz AMG wlewano do słoików, a rozmazy wywoływano przez 30 min w ciemnym pudełku.

Po wywołaniu rozmazy płukano w bieżącej wodzie dejonizowanej przez 10 min, umieszczano w 5% tiosiarczanie sodu na 5 min, przemywano bieżącą wodą dejonizowaną przez 2 min, utrwalano 70% etanolem przez 30 min, a na koniec przemywano bieżącą wodą dejonizowaną przez 2 min. Kontrbarwienie wykonano 0,1% wodnym roztworem błękitu toluidyny, pH 4,0 (1 g błękitu toluidyny w 1000 ml buforu: 614,5 ml 0,1 M monohydratu kwasu cytrynowego i 385,5 ml 0,2 M dihydratu wodorofosforanu dwusodowego; Merck, Darmstadt, Niemcy). Wymazy umieszczano na 2 × 2 min w wodzie destylowanej, 3 × 3 min w 99% etanolu, 3 × 3 min w ksylenie, a na koniec utrwalano preparatem DEPEX (Merck, Darmstadt, Niemcy).

Przygotowanie rozmazów nasienia do analizy mikroskopii elektronowej

Wymazy próbek nasienia przygotowywano w sposób opisany powyżej, z tym że nie utrwalano ich preparatem DEPEX. Po zabiegu dodawano 0,5% tetratlenek osmu na 30 min, a rozmazy umieszczano na 3×2 min w buforze i 1×2 min w wodzie destylowanej. Skontrastowane osmem rozmazy badano w mikroskopie świetlnym, a obszary zainteresowania do dalszych analiz mikroskopii elektronowej zaznaczano nożem diamentowym.

Wybrane rozmazy odwadniano w stopniowanych roztworach etanolu i zatapiano w Epon (Bie & Berntsen). Bloczki Epon umieszczone na uprzednio zaznaczonych obszarach zainteresowania przechowywano w temperaturze 60°C przez 24 h, a następnie odłamywano szklane rozmazy. Wycinano półcienkie (3 μm) wycinki i umieszczano je na szkiełkach mikroskopowych. Po lekkiej analizie mikroskopowej wybrane sekcje ponownie zatapiano w Epon, a ultracienkie sekcje wykonywano i kontrbarwiono cytrynianem ołowiu przed badaniem w mikroskopie elektronowym JEOL 100S.

Metody statystyczne

Wielokrotne analizy regresji zastosowano do danych w celu wykrycia wpływu poszczególnych parametrów na wynik. Współczynniki korelacji rang Spearmana zostały obliczone dla kilku korelacji. Do porównania grup zastosowano test Wilcoxona dla różnic w medianach.

Wyniki

W tabeli I przedstawiono zawartość cynku, magnezu i wapnia oraz względny udział tych kationów w osoczu nasienia. Porównanie median tych parametrów w dwóch grupach S-TTP versus L-TTP za pomocą testu t dwóch prób nie wykazało istotnych statystycznie różnic dla żadnego z tych parametrów. Stwierdzono silną dodatnią korelację między cynkiem, magnezem i wapniem (współczynniki korelacji rang Spearmana wynosiły 0,79-0,86, P < 0,01) (Rycina 1).

Żaden z tych kationów nie był ściśle skorelowany z żadnym z konwencjonalnych parametrów nasienia. Podczas analizy regresji wielokrotnej na wszystkich danych tylko zawartość cynku wyszła z wartością P poniżej 0,05 dla następujących parametrów CASA: VSL 0,04, i LIN 0,008. Wprowadzenie do modelu magnezu lub wapnia nie poprawiło wartości.

Próbki nasienia podzielono na dwie grupy o równej wielkości w zależności od statusu kationowego każdego kationu. Zidentyfikowano następujące punkty podziału (mediany dla wszystkich 50 próbek): cynk 112 mg/l, magnez 98 mg/l i wapń 476 mg/l. Stwierdzono szereg statystycznie istotnych różnic pomiędzy obiema grupami (tab. II). Wartości P dla grup cynku wskazywały na największe różnice, grupy wapnia miały różnice pośrednie, a grupy magnezu wykazywały jedynie słabe różnice (z wyjątkiem LIN).

Dla względnej proporcji między kationami (Tabela III) punktami podziału były: cynk:magnez 1,26, oraz cynk:wapń 0,22. Próbki o stosunku cynku do wapnia powyżej 0,22 wykazywały statystycznie istotne niższe wartości parametrów CASA VSL, LIN i STR w porównaniu z próbkami o stosunku poniżej 0,22. Korelacja cynk:magnez wynosi 0,86 (współczynnik korelacji rang Spearmana), a dla cynku:wapń 0,79. Zawartość cynku wydaje się być silniej związana z zawartością magnezu niż wapnia, co może tłumaczyć różnice pomiędzy grupami.

Podczas oceny zawartości jonów cynku w preparatach AMG wykryto różnicę na poziomie mikroskopu świetlnego w próbkach o niskiej zawartości cynku całkowitego w porównaniu z próbkami o wysokiej zawartości cynku całkowitego. Rycina 2 przedstawia różnice w barwieniu AMG w próbce o zawartości 299 mg/l i próbce o zawartości 53 mg/l cynku w nasieniu. Stwierdzono, że barwienie wokół akrosomu, ogona i w plazmie nasienia jest rzadkie w próbkach o niskiej zawartości całkowitego cynku. Nie było możliwe potwierdzenie tych wyników na poziomie mikroskopu elektronowego (rysunek 3A), a w szczególności nie zaobserwowano różnic w barwieniu wewnątrzkomórkowym plemników. Rysunki 3B i 4 pokazują lokalizację jonów cynku w ogonie plemnika. Występuje on w całym ogonie, koncentrując się w dodatkowych włóknach flagellarnych i błonie. W plazmie nasienia stwierdzono ciała mikrometrowej wielkości bogate w jony cynku (Rycina 5).

Dyskusja

Jest to według naszej najlepszej wiedzy pierwsze badanie oceniające wpływ cynku, magnezu i wapnia w nasieniu na parametry TTP i CASA u zdrowych ludzi. Stwierdzono związek pomiędzy wysokim stężeniem cynku a niską liniowością ruchów plemników wyrażającą się obniżeniem VAP, VSL, STR i LIN. Stężenia magnezu i wapnia były ściśle skorelowane ze stężeniem cynku, ale nie były tak silnie związane z parametrami CASA. Stwierdzono, że całkowite stężenie cynku, magnezu i wapnia nie miało wpływu na stężenie ruchliwe. Stwierdzono jednak różnice pomiędzy wysoką i niską zawartością cynku a niektórymi parametrami CASA (tab. II). Porównując 25 próbek nasienia o najniższej całkowitej zawartości cynku (mediana 72 mg/l) z 25 próbkami o najwyższej całkowitej zawartości cynku w nasieniu (mediana 187 mg/l), test sumy rang Wilcoxona wykazał statystycznie istotną różnicę w medianie dla VSL (P = 0,004), jak również LIN (P = 0,001). Dla VAP różnica ta była również istotna (P = 0,02). Nie stwierdzono różnicy dla VCL. Ponieważ w próbkach o niskiej i wysokiej zawartości cynku nie stwierdzono różnic w odsetku ruchliwych i koncentracji ruchliwości, wydaje się, że środowisko bogate w cynk powoduje, że plemniki poruszają się w sposób bardziej przypadkowy i mniej postępowy. Nie wydaje się, aby zmniejszało ono liczbę ruchliwych plemników.

VSL wyraża, jak daleko prosto do przodu porusza się plemnik w określonym czasie, i jest najprawdopodobniej, z klinicznego punktu widzenia, najważniejszym parametrem CASA. Badanie Moore’a i Akhondi (1996) nad zdolnością zapładniającą najądrza plemników szczura wykazało, że spadek VSL jest wysoce negatywnie skorelowany z wynikiem zapłodnienia in vitro.

Przez lata toczyło się wiele dyskusji na temat roli cynku w plazmie nasienia na funkcje plemników. Cynk jest niezbędny dla stabilności chromatyny i zdolności chromatyny do dekondensacji w odpowiednim czasie (Kvist, 1982; Kvist i Bjorndahl, 1985; Kvist i in., 1987, 1988), a także sugeruje się fizjologiczną rolę cynku jako konserwatora mechanizmu odrywania się główki od ogonka (Bjorndahl i Kvist, 1982). Istnieją jednak sprzeczne doniesienia na temat wpływu cynku w nasieniu na ruchliwość plemników, a większość badań dotyczyła oceny ilościowej. W badaniu Lewis-Jones i wsp. (1996) u 1178 pacjentów skierowanych na leczenie niepłodności zmierzono stężenie cynku i fruktozy w osoczu nasienia, ale w przypadku cynku nie stwierdzono istotnej statystycznie korelacji z ruchliwością. Abou-Shakra i wsp. (1989) dokonali pomiarów kilku pierwiastków śladowych w osoczu nasienia przy użyciu ICP-MS, ale nie stwierdzili korelacji stężenia cynku w nasieniu z gęstością lub ruchliwością plemników u mężczyzn normospermicznych, oligospermicznych lub azoospermicznych. Stężenia cynku w ich badaniu były podobne do poziomów prezentowanych w niniejszym opracowaniu. Danscher i wsp. (1978) stwierdzili, że wysokie stężenia cynku wiążą się z obniżoną ruchliwością plemników, podczas gdy inni stwierdzili, że wysoka zawartość cynku w plazmie nasienia wiąże się z wysokim stopniem ruchliwości komórek plemnikowych (Stankovic i Mikac-Devic, 1976; Caldamone i wsp., 1979).

W niniejszym badaniu zajmowaliśmy się zarówno ilościową oceną całkowitej zawartości cynku, jak i jakościowym określeniem lokalizacji jonów cynku w komórce plemnika i płynie nasiennym. Chociaż nie wykryto różnic w zawartości jonów cynku w plemnikach na poziomie ultrastrukturalnym (Figura 2A) pomiędzy próbkami o wysokiej lub niskiej zawartości cynku całkowitego, cechy widoczne na poziomie mikroskopu świetlnego (Figura 1) mogą odzwierciedlać związek pomiędzy całkowitą ilością cynku a wolnymi jonami cynku w plazmie nasienia. W ostatnich badaniach Lewis-Jones i wsp. (1996) oraz Carpino i wsp. (1998) stwierdzili, że całkowity cynk w nasieniu jest niewiarygodnym markerem aktywności spermatogennej i sugerują, że lepszym wskaźnikiem są biodostępne jony cynku związane z białkami pęcherzykowymi o dużej masie cząsteczkowej. Przedstawiona tu metoda AMG wykazuje cynk chelatowalny, tj. jony cynku w osoczu lub cynk luźno związany z makrocząsteczkami. Cynk związany trwale z białkami nie będzie wykrywany przez AMG i nie może być chelatowany. Zgadzamy się z cytowanymi badaniami, że to właśnie biodostępny (a więc chelatowalny) cynk wywiera funkcje na komórki plemników, w tym na ruchliwość. Niniejsze badanie wskazuje, że stężenia cynku całkowitego i chelatowalnego są ze sobą powiązane. Konieczne są dalsze badania, a komputerowa analiza obrazu np. preparatów AMG mogłaby być ważnym narzędziem.

W przeciwieństwie do wpływu cynku, wysokie stężenie magnezu samo w sobie nie wydawało się mieć żadnego hamującego wpływu na ruchliwość plemników. Stwierdzono negatywny wpływ na LIN, ale nie był on wystarczająco duży, aby mieć jakikolwiek wpływ na inne parametry CASA. Stwierdzono, że osocze nasienia ludzkiego zawiera ziarnistości wydzielnicze i pęcherzyki nasienne pochodzenia prostatycznego, które mogą mieć regulacyjny wpływ na ruchliwość plemników poprzez modulowanie stężenia niezbędnych kationów w ich otoczeniu (Stegmayr i in., 1982). Błony tych organelli zawieraj± ATPazę Mg2+- i Ca2+-zależn±, konkurencyjnie hamowan± przez Zn2+ (Ronquist i in., 1978a,b). Wysoka dodatnia korelacja pomiędzy cynkiem i magnezem w osoczu nasienia została wcześniej opisana (Papadimas i wsp., 1983; Umeyama i wsp., 1986), a w tym badaniu stwierdzono podobne silne wzajemne korelacje pomiędzy wszystkimi trzema kationami (r = 0,79-0,86, P < 0,01).

Wapń jest ważny dla fizjologii plemników, w tym dla ich ruchliwości (Morton i wsp., 1974; Lindemann et al., 1987), metabolizm (Peterson i Freund, 1976), reakcję akrosomalną i zapłodnienie (Yanagimachi i Usui, 1974; Yanagimachi, 1981). Rola wapnia w nasieniu w ruchliwości plemników nie jest jednak w pełni poznana. Thomas i Meizel (1988) stwierdzili, że chelatowanie zewnątrzkomórkowych jonów wapnia za pomocą EGTA hamuje reakcję akrosomalną, ale jednocześnie nie ma wpływu na ruchliwość. Dodanie indukującego reakcję akrosomalną jonoforu kationu dwuwartościowego – jonomycyny również nie miało wpływu na ruchliwość, ale znacząco zwiększyło liczbę plemników reagujących na akrosom. Magnus i wsp. (1990) nie stwierdzili związku pomiędzy stężeniem zjonizowanego wapnia a odsetkiem plemników wykazujących ruch postępowy. Arver i Sjöberg (1982) stwierdzili, że niskie stężenie zjonizowanego wapnia wiąże się z większą liczbą plemników wykazujących ruch postępowy i lepszą ich ruchliwością. Prien i wsp. (1990) porównali ruchliwość, prędkość i ruch postępowy plemników z całkowitym i zjonizowanym wapniem u pacjentów z normalną (>60%) i obniżoną (<60%) ruchliwością plemników. Nie stwierdzono różnicy w stężeniu wapnia całkowitego, ale stwierdzono statystycznie istotne zmniejszenie stężenia wapnia zjonizowanego w nasieniu u mężczyzn z obniżoną ruchliwością. W tym badaniu oznaczano wapń całkowity, ale nie jest znana zdolność plazmy nasienia do wiązania wapnia. Podobnie jak w przypadku wapnia, nie stwierdzono wpływu na stężenie ruchowe, a korelacje z parametrami CASA były słabsze niż w przypadku cynku (tab. II). Zarówno VSL, jak i LIN wykazywały odwrotnie istotne korelacje z całkowitym stężeniem wapnia (P = 0,02 dla obu), podczas gdy VCL pozostawał bez wpływu. Jednak dodanie stężenia cynku do analizy regresji wielokrotnej usunęło wpływ całkowitego stężenia wapnia na ruchliwość. Jest to zgodne z wcześniej wspomnianym badaniem Prien et al. (1990). W tym badaniu próbki o niskim stosunku cynku do wapnia wykazywały statystycznie istotne lepsze wartości CASA (VSL, LIN i STR) w porównaniu do próbek o wysokim stosunku. Wynika to głównie z różnic w stężeniu cynku.

Precyzja oznaczeń cynku, magnezu i wapnia w tym badaniu była stosunkowo słaba, ze współczynnikami zmienności wynoszącymi odpowiednio 18, 32 i 17%. Przyczyną tego jest prawdopodobnie niejednorodność próbek, co w połączeniu z małymi objętościami próbek (20 μl) mogło wpłynąć na pogorszenie precyzji. Pomimo dużej niedokładności, zmienność generowana w oznaczeniach cynku i magnezu była niewielka w porównaniu z dużym zakresem stężeń w próbkach.

Wcześniej wykazano, że chelatowanie jonów cynku wpływa na ruchliwość plemników u człowieka (Danscher i Rebbe, 1974), szczura i psa (Saito i in., 1967; Stoltenberg i in., 1997). Obecnie prowadzone są badania z wewnątrz- i zewnątrzkomórkową chelatacją jonów cynku, co może ujawnić znaczenie lokalizacji jonów cynku w płynie nasiennym i w komórce plemnika.

Autorzy pragną podziękować Pani H.Brandstrup, Pani D.Jensen, Pani K.Lunding, Pani K.Wiedemann, Pani Annie Akantis i Panu A.Meier za umiejętną pomoc techniczną. Duńska Grupa Badawcza Płodności wspierała to badanie, które jest częścią wspólnych badań nad środowiskowymi i biologicznymi determinantami płodności. Projekt jest koordynowany przez Steno Institute of Public Health, University of Aarhus i jest realizowany we współpracy z Department of Growth and Reproduction, National University Hospital w Kopenhadze. Badanie było głównie wspierane przez grant z Fundacji Badawczej Uniwersytetu w Aarhus (J 1994-7430-1). Dodatkowego wsparcia udzieliły również Danish Medical Research Council (J 12-2042-1), Danish Health Insurance Foundation (J 11/243-91, J 11/236-93), Fonden til Lægevidenskabens Fremme (A.P.Møller) oraz The Ciconia Foundation.

.