AFLATOXINS : Występowanie i zagrożenia dla zdrowia

Aflatoksyny są toksycznymi metabolitami wytwarzanymi przez niektóre grzyby w/na żywności i paszach. Są one prawdopodobnie najlepiej znanymi i najintensywniej badanymi mikotoksynami na świecie. Aflatoksyny zostały powiązane z różnymi chorobami, takimi jak aflatoksykoza, u zwierząt gospodarskich, zwierząt domowych i ludzi na całym świecie. Na występowanie aflatoksyn wpływają niektóre czynniki środowiskowe; stąd zakres skażenia będzie się różnił w zależności od położenia geograficznego, praktyk rolniczych i agronomicznych oraz podatności towarów na inwazję grzybów podczas okresów przed zbiorem, przechowywania i/lub przetwarzania. Aflatoksyny otrzymały większą uwagę niż jakiekolwiek inne mikotoksyny z powodu ich wykazanego potencjalnego działania rakotwórczego u podatnych zwierząt laboratoryjnych i ich ostrych skutków toksykologicznych u ludzi. Ponieważ zdano sobie sprawę, że absolutne bezpieczeństwo nigdy nie zostanie osiągnięte, wiele krajów podjęło próbę ograniczenia narażenia na aflatoksyny poprzez nałożenie limitów regulacyjnych na towary przeznaczone do użycia jako żywność i pasza.

Wprowadzenie

W 1960 roku ponad 100 000 młodych indyków na fermach drobiu w Anglii zmarło w ciągu kilku miesięcy z powodu pozornie nowej choroby, którą nazwano “chorobą Indyka X”. Wkrótce okazało się, że problem ten nie ograniczał się do indyków. Kaczęta i młode bażanty również zostały dotknięte chorobą i doświadczyły dużej śmiertelności.

Dokładne badanie wczesnych ognisk choroby wykazało, że wszystkie one były związane z paszami, a mianowicie z brazylijską mączką z orzeszków ziemnych. Podjęto intensywne badania podejrzanej mączki orzechowej i szybko stwierdzono, że ta mączka orzechowa była wysoce toksyczna dla drobiu i kaczek z objawami typowymi dla choroby Turkey X.

Spekulacje poczynione w 1960 r. dotyczące natury toksyny sugerowały, że może ona być pochodzenia grzybiczego. W rzeczywistości, grzyb wytwarzający toksynę został zidentyfikowany jako Aspergillus flavus (1961), a toksyna otrzymała nazwę Aflatoksyna ze względu na swoje pochodzenie (A.flavis–>Afla).

To odkrycie doprowadziło do rosnącej świadomości potencjalnych zagrożeń tych substancji jako zanieczyszczeń żywności i pasz powodujących choroby, a nawet śmierć u ludzi i innych ssaków. Badania, które są podsumowane w następujących sekcjach ujawniły, że aflatoksyny są produkowane głównie przez niektóre szczepy A. Flavus i przez większość, jeśli nie wszystkie, szczepy A. parasiticus , plus gatunki pokrewne, A. nomius i A.niger. Ponadto, badania te ujawniły, że istnieją cztery główne aflatoksyny: B1, B2, G1, G2 oraz dwa dodatkowe produkty przemiany materii, M1 i M2, które mają znaczenie jako bezpośrednie zanieczyszczenia żywności i pasz. Aflatoksyny M1 i M2 zostały po raz pierwszy wyizolowane z mleka zwierząt w okresie laktacji karmionych preparatami aflatoksyn; stąd oznaczenie M. Oznaczenie B aflatoksyn B1 i B2 wynikało z wykazywania niebieskiej fluorescencji w świetle UV, natomiast oznaczenie G odnosi się do żółto-zielonej fluorescencji odpowiednich struktur w świetle UV. Toksyny te mają bardzo podobną budowę i tworzą unikalną grupę silnie natlenionych, naturalnie występujących związków heterocyklicznych. Ich wzory molekularne ustalone na podstawie analiz elementarnych i oznaczeń spektrometrycznych mas są następujące:

• B1 : C17 H12 O6
• B2 : C17 H14 O6
• G1 : C17 H12 O7
• G2 : C17 H14 O7

Ustalono, że aflatoksyny B2 i G2 są odpowiednio dihydroksypochodnymi B1 i G1. Natomiast aflatoksyna M1 jest 4-hydroksy aflatoksyną B1, a aflatoksyna M2 jest 4-dihydroksy aflatoksyną B2.

Występowanie

W surowych produktach rolnych :

Aflatoksyny często występują w uprawach na polu przed zbiorem. Zanieczyszczenie po zbiorach może wystąpić, jeżeli suszenie upraw jest opóźnione i podczas przechowywania upraw, jeżeli woda przekracza wartości krytyczne dla rozwoju pleśni. Inwazje owadów lub gryzoni ułatwiają inwazję pleśni w niektórych przechowywanych towarach.

Aflatoksyny wykrywa się sporadycznie w mleku, serze, kukurydzy, orzeszkach ziemnych, nasionach bawełny, orzechach, migdałach, figach, przyprawach i wielu innych produktach spożywczych i paszach. Mleko, jaja i produkty mięsne są czasami skażone z powodu spożycia przez zwierzęta paszy skażonej aflatoksynami. Jednak towary zthe najwyższe ryzyko skażenia aflatoksyną są kukurydza, orzeszki ziemne, i nasiona bawełny.

W przetworzonej żywności :

Kukurydza jest prawdopodobnie towarem budzącym największe obawy na całym świecie, ponieważ jest uprawiana w klimatach, w których istnieje prawdopodobieństwo wieloletniego skażenia aflatoksynami, a kukurydza jest podstawowym pożywieniem wielu krajów. Jednakże procedury stosowane w przetwarzaniu kukurydzy pomagają zmniejszyć zanieczyszczenie otrzymanego produktu spożywczego. Wynika to z faktu, że chociaż aflatoksyny są stabilne lub umiarkowanie stabilne w większości procesów spożywczych, są one niestabilne w procesach takich jak te stosowane w produkcji tortilli, które wykorzystują warunki alkaliczne lub etapy utleniania. Skażona aflatoksynami kukurydza i mączka z nasion bawełny w racjach mlecznych spowodowały skażenie aflatoksyną M1 mleka i produktów mlecznych, w tym beztłuszczowego mleka suchego, sera i jogurtu.

Czynniki sprzyjające produkcji aflatoksyn

Rozwój grzybów i skażenie aflatoksynami są konsekwencją interakcji pomiędzy grzybem, gospodarzem i środowiskiem. Odpowiednia kombinacja tych czynników określa porażenie i kolonizację podłoża oraz rodzaj i ilość wytwarzanej aflatoksyny. Jednakże, odpowiednie podłoże jest wymagane do wzrostu grzyba i późniejszej produkcji toksyn, chociaż dokładny czynnik(i), który inicjuje tworzenie toksyn nie jest dobrze poznany. Stres wodny, stres wysokiej temperatury i uszkodzenia roślin żywicielskich przez owady są głównymi czynnikami determinującymi porażenie pleśnią i produkcję toksyn. Podobnie, specyficzne fazy wzrostu upraw, słaba żyzność, wysokie zagęszczenie upraw i konkurencja chwastów zostały powiązane ze zwiększonym wzrostem pleśni i produkcją toksyn. Na powstawanie aflatoksyn ma również wpływ powiązany wzrost innych pleśni lub mikroorganizmów. Na przykład, przedżniwnemu skażeniu aflatoksynami orzeszków ziemnych i kukurydzy sprzyjają wysokie temperatury, długotrwałe warunki suszy i duża aktywność owadów; natomiast pożniwnemu wytwarzaniu aflatoksyn w kukurydzy i orzeszkach ziemnych sprzyjają ciepłe temperatury i wysoka wilgotność.

Aflatoksykoza i zdrowie zwierząt

Aflatoksykoza jest przede wszystkim chorobą wątroby. Podatność poszczególnych zwierząt na aflatoksyny różni się znacznie w zależności od gatunku, wieku, płci i żywienia. W rzeczywistości aflatoksyny powodują uszkodzenia wątroby, zmniejszenie produkcji mleka i jaj, nawracające infekcje w wyniku obniżenia odporności (np. salmonelloza), a także embriotoksyczność u zwierząt spożywających niskie stężenia w diecie. Podczas gdy młode osobniki danego gatunku są najbardziej podatne, choroba dotyka wszystkich grup wiekowych, ale w różnym stopniu w przypadku różnych gatunków. Objawy kliniczne aflatoksykozy u zwierząt obejmują dysfunkcję przewodu pokarmowego, zmniejszoną rozrodczość, zmniejszone wykorzystanie paszy i wydajność, niedokrwistość i żółtaczkę. U zwierząt karmiących może wystąpić w wyniku przekształcenia aflatoksyny B1 w metabolitaflatoksynę M1 wydzielaną w mleku bydła mlecznego.

Indukcja raka przez aflatoksyny była szeroko badana. Wykazano, że aflatoksyna B1, aflatoksyna M1 i aflatoksyna G1 powodują różne rodzaje raka u różnych gatunków zwierząt. Jednakże tylko aflatoksyna B1 jest uważana przez Międzynarodową Agencję Badań nad Rakiem (IARC) za posiadającą wystarczające dowody rakotwórczości u zwierząt doświadczalnych, aby zostać zidentyfikowaną jako czynnik rakotwórczy.

Aflatoksyny a zdrowie człowieka

Ludzie są narażeni na aflatoksyny poprzez spożywanie żywności zanieczyszczonej produktami wzrostu grzybów. Trudno jest uniknąć takiego narażenia, ponieważ niełatwo jest zapobiec rozwojowi grzybów w żywności. Nawet jeśli silnie zanieczyszczone dostawy żywności nie są dopuszczone na rynek w krajach rozwiniętych, nadal istnieje obawa o możliwe niekorzystne skutki wynikające z długotrwałej ekspozycji na niskie poziomy aflatoksyn w dostawach żywności.
Dowody ostrej aflatoksykozy u ludzi zostały zgłoszone z wielu części świata, a mianowicie krajów Trzeciego Świata, takich jak Tajwan, Ouganda, Indie, i wiele innych. Zespół charakteryzuje się wymiotami, bólem brzucha, obrzękiem płuc, drgawkami, śpiączką i śmiercią z obrzękiem mózgu i tłuszczowym zajęciem wątroby, nerek i serca.

Warunki zwiększające prawdopodobieństwo ostrej aflatoksykozy u ludzi obejmują ograniczoną dostępność żywności, warunki środowiskowe, które sprzyjają rozwojowi grzybów w uprawach i towarach oraz brak systemów regulacyjnych do monitorowania i kontroli aflatoksyn.

Najnowsze metody analizy aflatoksyn w żywności i paszach

Pobieranie i przygotowanie próbek :

Pobieranie i przygotowanie próbek pozostaje znaczącym źródłem błędów w analitycznej identyfikacji aflatoksyn. Dlatego systematyczne pobieranie próbek, przygotowywanie próbek i analiza są absolutnie konieczne do oznaczania aflatoksyn na poziomie części na miliard. W tym względzie opracowano specjalne plany i rygorystycznie je przetestowano dla niektórych towarów, takich jak kukurydza, orzeszki ziemne i orzechy drzewne; plany pobierania próbek dla niektórych innych towarów były wzorowane na nich. Wspólną cechą wszystkich planów pobierania próbek jest to, że cała próbka pierwotna musi być zmielona i wymieszana tak, aby część przeznaczona do badań analitycznych miała takie samo stężenie toksyny jak próbka pierwotna.

Ekstrakcja w fazie stałej :

Wszystkie procedury analityczne obejmują trzy etapy: ekstrakcję, oczyszczanie i oznaczanie. Najbardziej znaczącym ostatnio udoskonaleniem etapu oczyszczania jest zastosowanie ekstrakcji do fazy stałej.
Ekstrakty testowe są oczyszczane przed analizą instrumentalną (chromatografia cienkowarstwowa lub cieczowa) w celu usunięcia współekstraktowanych materiałów, które często zakłócają oznaczanie analitów docelowych.

Chromatografia cienkowarstwowa :

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC), znana również jako chromatografia płaska lub chromatografia planarna, jest jedną z najszerzej stosowanych technik rozdzielania w analizie aflatoksyn. Od 1990 r. jest ona uznawana za oficjalną metodę AOAC oraz metodę z wyboru do identyfikacji i oznaczania ilościowego aflatoksyn na poziomach tak niskich jak 1 ng/g. Metoda TLC jest również stosowana do weryfikacji wyników za pomocą nowszych, szybszych technik.

Chromatografia cieczowa :

Chromatografia cieczowa (LC) jest podobna do TLC pod wieloma względami, włączając w to zastosowanie analitu, fazę stacjonarną i fazę ruchomą. Chromatografia cieczowa i TLC uzupełniają się wzajemnie. Dla analityka użycie TLC do wstępnej pracy w celu zoptymalizowania warunków rozdzielania LC nie jest niczym niezwykłym.
Metody chromatografii cieczowej do oznaczania aflatoksyn w żywności obejmują LC z normalną fazą (NPLC), LC z odwróconą fazą (RPLC) z derywatyzacją przed lub przedkolumnową (BCD), RPLC z derywatyzacją po kolumnie (PCD) oraz RPLC z detekcją elektrochemiczną.

Metody immunochemiczne :

Chromatografia cienkowarstwowa i metody LC do oznaczania aflatoksyn w żywności są pracochłonne i czasochłonne. Często techniki te wymagają znajomości i doświadczenia w zakresie technik chromatograficznych w celu rozwiązania problemów związanych z separacją i interferencją. Dzięki postępowi w biotechnologii, dostępne są obecnie w handlu wysoce specyficzne testy oparte na przeciwciałach, które mogą identyfikować i mierzyć aflatoksyny w żywności w czasie krótszym niż 10 minut. Testy te opierają się na powinowactwie przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych do aflatoksyn. Trzy rodzaje metod immunochemicznych to metoda radioimmunologiczna (RIA), próba immunosorbcyjna skoniugowana z enzymem (ELISA) i próba z kolumną powinowactwa immunologicznego (ICA).

Potwierdzenie tożsamości aflatoksyn :

Mimo że metody analityczne mogą składać się z różnych etapów ekstrakcji, oczyszczania i oznaczania ilościowego, wyniki analiz wykonywanych takimi metodami powinny być podobne, jeżeli metody są stosowane prawidłowo. Ponieważ wiarygodność danych ilościowych nie jest kwestionowana, problemem, który pozostaje do rozwiązania, jest potwierdzenie tożsamości aflatoksyn. Stosowane techniki potwierdzania obejmują chemiczną derywatyzację lub spektrometrię mas (MS).

Kwestie bezpieczeństwa w postępowaniu ze zmętniałymi ziarnami i aflatoksynami :

Bezpieczeństwo jest kluczową kwestią dla naukowców pracujących w obszarze aflatoksyn.Należy podjąć kroki w celu zminimalizowania narażenia na toksyny, jak również na mikroorganizmy wytwarzające, Aspergillus flavus i Aspergillusparasiticus. Należy ustanowić program bezpieczeństwa, który spełnia wymagania normy laboratoryjnej Occupational Safety andHealth Administration (1990) oraz wytycznych National Institutesof Health (1981) obejmujących stosowanie chemicznych czynników rakotwórczych.

Techniki monitorowania w celu oceny narażenia człowieka na aflatoksyny

W ciągu ostatnich kilku lat opracowano nowe technologie, które dokładniej monitorują indywidualne narażenie na aflatoksyny. Szczególną uwagę zwrócono na analizę adduktów DNA aflatoksyny i adduktów albumin jako surogatów genotoksyczności u ludzi. Autrup i wsp. (1983) byli pionierami w stosowaniu synchronicznej spektroskopii fluorescencyjnej do pomiaru adduktów DNA aflatoksyn w moczu. W próbkach moczu zebranych po ekspozycji na alfatoksyny stwierdzono obecność 2,3-dihydroksy-2-(N7-guanylo)-3-hydroksyaflatoksynyB1, trywialnie znanej jako AFB-Gual . Wild et al.(1986) wykorzystali wysoce czułe testy immunologiczne do ilościowego oznaczania aflatoksyn w ludzkich płynach ustrojowych. Do oznaczania ilościowego aflatoksyny B1 w zakresie od 0,01 ng /ml do 10 ng/ml zastosowano test immunoenzymatyczny (ELISA), który został zwalidowany w próbkach ludzkich moczu. Stosując tę metodę, stwierdzono, że wydalanie adduktu aflatoksyny-DNA z moczem jest pozytywnie skorelowane ze spożyciem pokarmu, a główny addukt aflatoksyny B1-DNA wydalany z moczem jest odpowiednim miernikiem do monitorowania narażenia na aflatoksynę w diecie.

Kontrola i zarządzanie aflatoksynami

A- Kontrola regulacyjna :

Aflatoksyny są uważane za nieuniknione zanieczyszczenia żywności i paszy, nawet w przypadku, gdy przestrzegano dobrych praktyk produkcyjnych. FDA ustanowiła szczegółowe wytyczne dotyczące dopuszczalnych poziomów aflatoksyn w żywności dla ludzi i paszach dla zwierząt poprzez ustanowienie poziomów działania, które pozwalają na usunięcie z handlu partii naruszających przepisy. Poziom działania dla żywności dla ludzi wynosi 20 ppb aflatoksyn ogółem, z wyjątkiem mleka, które ma poziom działania 0,5 ppb dla aflatoksyny M1. Poziom działania dla większości pasz wynosi również 20 ppb. Jednakże bardzo trudno jest dokładnie oszacować stężenie aflatoksyn w dużejilości materiału z powodu zmienności związanej z procedurami badawczymi; stąd, prawdziwe stężenie aflatoksyn w partii nie może być określone ze 100% pewnością.

B- Strategie detoksykacji :

Ponieważ zanieczyszczenie aflatoksynami jest nieuniknione, zaproponowano liczne strategie ich detoksykacji. Obejmują one fizyczne metody separacji, inaktywację termiczną, napromieniowanie, ekstrakcję rozpuszczalnikową, adsorpcję z roztworu, inaktywację mikrobiologiczną i fermentację. Chemiczne metody detoksykacji są również praktykowane jako główna strategia skutecznej detoksykacji:

Degradacja strukturalna po obróbce chemicznej :
Różna grupa substancji chemicznych została przebadana pod kątem zdolności do rozkładu i inaktywacji aflatoksyn. Wiele z tych substancji chemicznych może reagować w celu zniszczenia (lub degradacji) aflatoksyn skutecznie, ale większość z nich jest niepraktyczna lub potencjalnie nie jest bezpieczna ze względu na tworzenie się toksycznych pozostałości lub zakłócenia zawartości składników odżywczych i właściwości organoleptyczne produktu. Dwa chemiczne podejścia do detoksykacji aflatoksyn, które uzyskały znaczną uwagę, to amonifikacja i reakcja z wodorosiarczynem sodu.
Wiele badań dostarcza dowodów, że obróbka chemiczna poprzez amonifikację może stanowić skuteczną metodę detoksykacji skażonej aflatoksynami kukurydzy i innych towarów. Mechanizm tego działania wydaje się obejmować hydrolizę pierścienia laktonowego i chemiczną konwersję związku macierzystego aflatoksyny B1 do licznych produktów, które wykazują znacznie zmniejszoną toksyczność.
Z drugiej strony, wykazano, że wodorosiarczyn sodu reaguje z aflatoksynami (B1, G1 i M1) w różnych warunkach temperatury, stężenia i czasu, tworząc produkty rozpuszczalne w wodzie.

Modyfikacja toksyczności przez dietetyczne substancje chemiczne :
Toksyczność mikotoksyn może być pod silnym wpływem dietetycznych substancji chemicznych, które zmieniają normalne odpowiedzi systemów ssaków na te substancje.Zmienna gama czynników chemicznych, w tym składników odżywczych (np. białka i tłuszczu w diecie, witamin i pierwiastków śladowych), dodatków do żywności i paszy (np. antybiotyków i środków konserwujących), jak również innych czynników chemicznych może oddziaływać na skutki aflatoksyn u zwierząt.

Alteration of Bioavailability by Aflatoxin chemisorbents :
Nowym podejściem do detoksykacji aflatoksyn jest dodanie nieorganicznych materiałów sorbentowych, znanych jako chemisorbenty, takich jak uwodniony glinokrzemian wapnia sodu (HSCAS) do diety zwierząt. HSCAS possessesthe ability to tightly bind and immobilize aflatoxins in the gastrointestinaltract of animals, resulting in a major reduction in aflatoxin bioavailability.

Economic Impact of Aflatoxins

Ekonomiczny wpływ aflatoksyn wynikający bezpośrednio ze strat w uprawach i zwierzętach gospodarskich, jak również pośrednio z kosztów programów regulacyjnych mających na celu zmniejszenie ryzyka dla zdrowia zwierząt i ludzi. Organizacja ds. Wyżywienia i Rolnictwa (FAO) szacuje, że 25% światowych upraw żywności jest dotkniętych mikotoksynami, z których najbardziej znane są aflatoksyny. Straty, jakie ponoszą producenci zwierząt gospodarskich i drobiu w wyniku skażenia pasz aflatoksynami, obejmują śmierć oraz bardziej subtelne skutki w postaci osłabienia układu odpornościowego, zmniejszenia tempa wzrostu i spadku wydajności pasz. Inne niekorzystne skutki ekonomiczne aflatoksyn obejmują niskie plony roślin spożywczych i włóknistych.

Ponadto zdolność aflatoksyn do wywoływania raka i związanych z nim chorób u ludzi, biorąc pod uwagę ich pozornie nieuniknione występowanie w żywności i paszach, sprawia, że zapobieganie i detoksykacja tych mikotoksyn jest jednym z najtrudniejszych problemów toksykologicznych w obecnym czasie.

Anon. 1989. Mycotoxins , Economic and Health Risks. Council forAgricultural science and Technology, Report No.116 pp91.

Eaton, D.L. and Groopman, J.D. 1994. The Toxicology of Aflatoxins. AcademicPress, New York. pp383-426.

Finley, J.W.,Robinson, S.F. i Armstrong, D.J. 1992. Food Safety Assessment.American Chemical Society, Washington, D.C. pp261-275.

Goldbatt, L.A. 1969. Aflatoksyna. Academic Press,New York. pp1-40.

Heathcote, J.G. and Hibbert, J.R. 1978. Aflatoksyny: aspekt chemiczny i biologiczny. Elsevier, New York. pp.173-186.

Liener, I.E. 1969. Składniki toksyny z roślinnych środków spożywczych. AcademicPress , New york. pp392-394.

Wyllie, T.D. i Morchause,L.G. 1978. Mycotoxin Fungi, Mycotoxins,Mycotoxicoses-An Encyclopedic Handbook.Vols.1,2, and 3.Marcel Dekker, Inc. Newyork.