ImmunohistochemiaEdit

Immunohistochemia lub barwienie IHC wycinków tkanek (lub immunocytochemia, która jest barwieniem komórek), jest prawdopodobnie najczęściej stosowaną techniką barwienia immunologicznego. Podczas gdy w pierwszych przypadkach barwienia IHC stosowano barwniki fluorescencyjne (patrz immunofluorescencja), obecnie stosuje się inne, niefluorescencyjne metody wykorzystujące enzymy, takie jak peroksydaza (patrz barwienie immunoperoksydazowe) i fosfataza alkaliczna. Enzymy te są zdolne do katalizowania reakcji dających barwny produkt, który jest łatwo wykrywalny w mikroskopie świetlnym. Alternatywnie, elementy radioaktywne mogą być używane jako etykiety, a reakcja immunologiczna może być wizualizowana przez autoradiografię.

Przygotowanie lub utrwalenie tkanki jest istotne dla zachowania morfologii komórek i architektury tkanki. Nieodpowiednie lub przedłużone utrwalanie może znacznie zmniejszyć zdolność wiązania przeciwciał. Wiele antygenów może być z powodzeniem demonstrowanych w utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie wycinkach tkanek. Jednakże, niektóre antygeny nie przetrwają nawet umiarkowanych ilości utrwalania aldehydem. W takich warunkach tkanki powinny być szybko świeżo zamrożone w ciekłym azocie i pocięte za pomocą kriostatu. Wady mrożonych wycinków obejmują słabą morfologię, słabą rozdzielczość przy większych powiększeniach, trudności w cięciu nad parafiną i konieczność przechowywania w stanie zamrożonym. Alternatywnie, sekcje wibratomowe nie wymagają przetwarzania tkanki przez rozpuszczalniki organiczne lub wysoką temperaturę, które mogą zniszczyć antygenowość, lub zakłócić ją przez zamrażanie i rozmrażanie. Wadą przekrojów wibratomowych jest to, że proces sekcjonowania jest powolny i trudny w przypadku miękkich i słabo utrwalonych tkanek, oraz to, że w przekrojach często widoczne są ślady paproszków lub linie wibratomowe.

Detekcja wielu antygenów może być znacznie ulepszona dzięki metodom odzyskiwania antygenów, które działają poprzez zerwanie niektórych białkowych wiązań krzyżowych utworzonych przez utrwalanie, aby odsłonić ukryte miejsca antygenowe. Można to osiągnąć przez ogrzewanie przez różną długość czasu (heat induced epitope retrieval lub HIER) lub używając trawienia enzymatycznego (proteolytic induced epitope retrieval lub PIER).

Jedną z głównych trudności w barwieniu IHC jest pokonanie specyficznego lub niespecyficznego tła. Optymalizacja metod i czasów utrwalania, wstępna obróbka środkami blokującymi, inkubacja przeciwciał z dużą ilością soli oraz optymalizacja buforów do płukania po przeciwciałach i czasów płukania są ważne dla uzyskania wysokiej jakości barwienia immunologicznego. Dodatkowo, obecność pozytywnych i negatywnych kontroli dla barwienia jest niezbędna do określenia specyficzności.

Cytometria przepływowaEdit

Cytometr przepływowy może być używany do bezpośredniej analizy komórek wyrażających jedno lub więcej specyficznych białek. Komórki są barwione immunologicznie w roztworze przy użyciu metod podobnych do tych stosowanych w immunofluorescencji, a następnie analizowane za pomocą cytometrii przepływowej.

Cytometria przepływowa ma kilka zalet w porównaniu z IHC, w tym: zdolność do definiowania odrębnych populacji komórek na podstawie ich wielkości i ziarnistości; zdolność do wykluczenia martwych komórek; zwiększoną czułość; oraz analizę wielokolorową do jednoczesnego pomiaru kilku antygenów. Jednakże, cytometria przepływowa może być mniej skuteczna w wykrywaniu niezwykle rzadkich populacji komórek, a w przypadku braku wycinka tkanki następuje utrata relacji architektonicznych. Cytometria przepływowa ma również wysoki koszt kapitałowy związany z zakupem cytometru przepływowego.

Western blottingEdit

Western blotting umożliwia wykrywanie specyficznych białek z ekstraktów wykonanych z komórek lub tkanek, przed lub po jakichkolwiek etapach oczyszczania. Białka są zazwyczaj rozdzielane według wielkości przy użyciu elektroforezy żelowej przed przeniesieniem na syntetyczną membranę za pomocą suchych, półsuchych lub mokrych metod blottingu. Membrana może być następnie sondowana przy użyciu przeciwciał przy użyciu metod podobnych do immunohistochemii, ale bez potrzeby utrwalania. Wykrywanie jest zazwyczaj przeprowadzane przy użyciu przeciwciał związanych z peroksydazą w celu katalizowania reakcji chemiluminescencyjnej.

Western blotting jest rutynową metodą biologii molekularnej, która może być stosowana do półilościowego porównywania poziomów białek pomiędzy ekstraktami. Rozdział wielkości przed blottingiem pozwala na ocenę masy cząsteczkowej białka w porównaniu ze znanymi markerami masy cząsteczkowej.

Enzyme-linked immunosorbent assayEdit

Enzyme-linked immunosorbent assay lub ELISA jest metodą diagnostyczną służącą do ilościowego lub półilościowego określania stężenia białka z osocza krwi, surowicy lub ekstraktów komórkowych/tkankowych w formacie płytek wielodołkowych (zwykle 96 dołków na płytkę). Ogólnie rzecz biorąc, białka w roztworze są adsorbowane na płytkach ELISA. Przeciwciała specyficzne dla interesującego nas białka są używane do sondowania płytki. Tło jest minimalizowane poprzez optymalizację metod blokowania i płukania (jak w przypadku IHC), a specyficzność jest zapewniona poprzez obecność kontroli pozytywnych i negatywnych. Metody detekcji są zazwyczaj kolorymetryczne lub oparte na chemiluminescencji.

Mikroskopia immunoelektronowaEdit

Mikroskopia elektronowa lub EM może być stosowana do badania szczegółowej mikroarchitektury tkanek lub komórek. ImmunoEM pozwala na wykrywanie specyficznych białek w ultracienkich przekrojach tkanek. Przeciwciała znakowane cząsteczkami metali ciężkich (np. złota) mogą być bezpośrednio wizualizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Chociaż immunoEM jest skuteczny w wykrywaniu subkomórkowej lokalizacji białka, może być trudny technicznie, kosztowny i wymaga rygorystycznej optymalizacji metod utrwalania i przetwarzania tkanek. Biotynylacja białek in vivo została zaproponowana w celu złagodzenia problemów wynikających z częstej niezgodności barwienia przeciwciał z protokołami utrwalania, które lepiej zachowują morfologię komórek.