Dr Bang był bardzo zainteresowany układami krążenia bezkręgowców. Wierzył, że studiowanie zwierząt, u których można obserwować krążenie, doprowadzi do lepszego zrozumienia procesów fizjologicznych u kręgowców, takich jak ludzie.
W początkach lat pięćdziesiątych, kiedy był w Morskim Laboratorium Biologicznym w Wood’s Hole w stanie Maine, Bang badał układ krążenia kraba podkowiastego i jego odpowiedź na infekcję bakteryjną.
Wstrzykiwał bakterie uzyskane ze słodkiej wody morskiej krabom podkowiastym różnej wielkości i badał ich reakcję. Zwykle krew tworzyła mały skrzep, który zamykał zainfekowane miejsce i powstrzymywał bakterie przed dostaniem się do środka.
Ale pewnego dnia Bang zauważył, że jeden z jego krabów zmarł z powodu nieznanej infekcji, która spowodowała, że prawie cała objętość krwi w krabie skrzepła w półstałą masę.
Tego nigdy wcześniej nie widziano!
Wyizolował więc i wyhodował bakterię z pierwszego zwierzęcia i wstrzyknął ją innym podkowcom. One również doświadczyły identycznego krzepnięcia i zmarły.
Badając dalej, odkrył, że tylko bakterie Gram-ujemne wywołują tę reakcję.
Note: In 1884, Hans Christian Gram invented a staining procedure for microscopy which came to be called The Gram stain. It stains the bacteria either red (Gram-negative) or violet (Gram-positive) depending on the chemicals they have in their cell walls.
Bakterie Gram-ujemne powodują infekcje, takie jak zapalenie płuc i zapalenie opon mózgowych. Kiedy Bang uśmiercił bakterie przed wstrzyknięciem, nadal uzyskiwał tę samą reakcję krzepnięcia. Oznaczało to, że żywe bakterie nie były wymagane do spowodowania krzepnięcia krwi kraba podkowiastego.
Opublikował swoje odkrycia w 1956 roku i odłożył na bok swoje początkowe obserwacje na prawie 10 lat.
Przyszedł Jack Levin.
W 1963 roku, gdy Bang omawiał dane ze swojego projektu dotyczącego kraba podkowiastego, jeden z kolegów zasugerował, że współpraca z hematologiem może pomóc w rozwikłaniu zagadki krzepnięcia. Kolega polecił współpracownika ze swojego laboratorium, dr Jacka Levina.
Levin wykorzystywał króliki do badania Reakcji Shwartzmana – reakcji na endotoksyny, która powoduje tworzenie się skrzepu wewnątrz naczynia krwionośnego, a także zmienia funkcję płytek krwi kręgowców.
Endotoksyna jest kluczowym składnikiem ściany komórkowej wszystkich bakterii Gram-ujemnych; może być trudna do wykrycia i jest odporna na leki.
Bang namówił Levina do spędzenia lata w Marine Biological Laboratory w Woods Hole, gdzie badał podobieństwa między amebocytami Limulusa a ludzkimi płytkami krwi.
Szybko wykazał, że bezkomórkowe osocze z kraba podkowiastego nie krzepnie, ale kiedy badał komórki krwi, miał problemy z utrzymaniem krwi przed krzepnięciem.
Miał też inny problem. Próbki, które były w porządku, gdy opuszczał laboratorium w nocy, krzepły, gdy wracał rano, a żaden z dostępnych na rynku antykoagulantów nie robił różnicy.
Serendipity Leads to an Aha! Moment
Levin był zdumiony i coraz bardziej zdesperowany, aby to rozgryźć!
Czy mogło to być spowodowane przez bakterie lub jakiś składnik bakterii?
Aby sprawdzić tę możliwość, przygotował nowe próbki w sterylnych, wolnych od endotoksyn szklanych naczyniach. Co zadziwiające, krew nie krzepła!
Wtedy zdał sobie sprawę, że zidentyfikował mechanizm krzepnięcia krwi, który był uruchamiany przez obecność endotoksyny bakterii Gram-ujemnych.
W końcu udało mu się wykazać, że cały mechanizm krzepnięcia krwi w Limulusie był zawarty w amebocytach i był niezwykle wrażliwy na obecność endotoksyn.
Amebocyty Limulus polyphemus
“Myślę, że tylko badacz, który pracował z endotoksyną, kiedykolwiek wziąłby pod uwagę możliwość, że endotoksyna powoduje krzepnięcie krwi Limulusa”, mówi Levin.
Doprowadziło to do stworzenia i opatentowania przez Levina niezwykle czułego testu Limulus Amebocyte Lysate (LAL), który mógł badać endotoksyny bakteryjne przy użyciu krwi kraba podkowiastego.
Jedyny inny test na endotoksyny w tamtym czasie nosił nazwę Rabbit Pyrogen Test. W tym czasie, Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków wymagała, aby wszystkie leki do wstrzykiwania przeszły test pirogenów zanim zostaną dopuszczone do użytku.
Jednakże, Test Pirogenów Króliczych był kosztownym, nieefektywnym i często niedokładnym procesem.
Wstrzykiwałeś próbkę w grupę królików. Jeśli u tych królików wystąpiła gorączka, lek nie przeszedł testu. Jeśli nie dostały gorączki w ciągu 4-6 godzin, test wypadał pozytywnie.
Przedsiębiorstwa farmaceutyczne musiały trzymać tysiące królików, aby wykonać te testy.
Test LAL może zwrócić wynik już po 45 minutach i może wykryć obecność endotoksyn na poziomie mniejszym niż jedna część na bilion.
Levin zdał sobie sprawę, że ma bardzo czuły i szybki test! To była ostra konkurencja dla testu króliczego.
Test LAL może zwrócić wynik w ciągu zaledwie 45 minut i może wykryć obecność endotoksyn na poziomie mniejszym niż jedna część na bilion.
Pomimo, że test LAL został po raz pierwszy opisany w 1965 roku, minęło prawie 20 lat zanim został on formalnie zatwierdzony przez FDA jako test na obecność endotoksyn w produktach końcowych!
Dlaczego trwało to tak długo?!
Patrzmy prawdzie w oczy, ludzie nie lubią zmieniać rzeczy, a firmy naprawdę opierają się zmianom. Przyjęcie nowego, bardziej czułego testu oznaczało, że firmy farmaceutyczne musiałyby przeprojektować i uruchomić całą nową linię produkcyjną.
To czas i pieniądze!
Ale śmietanka w końcu wznosi się na szczyt; ten test był śmietanką plonów i nadal nią jest!
Popyt na LAL jest teraz tak wysoki, że stał się jednym z najcenniejszych płynów na Ziemi, z ceną zgłoszoną w kwietniu 2018 r. między 35 000 a 60 000 USD za galon!
Skalowanie testu LAL
Test LAL został uznany za jeden ze “100 najważniejszych wkładów w zdrowie publiczne” przez Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health.
Według Jacka Levina jest to standardowy test przesiewowy na skażenie endotoksynami na całym świecie, z około 17,5 milionami przetestowanych próbek (co daje w przybliżeniu 70 milionów wykonanych testów) każdego roku. Jest on stosowany komercyjnie do badania wszystkich płynów dożylnych, leków pozajelitowych i wszczepialnych urządzeń medycznych przed ich zastosowaniem u pacjentów.
Jak powstaje LAL?
Horseshoe crabs are captured and a tube is stuck into them to siphon off their blood (see the picture above). Następnie zebrana krew jest odwirowywana w celu skoncentrowania amebocytów. Dodanie wody do upakowanych amebocytów powoduje ich rozpad i uwolnienie białek koagulacyjnych (lizatu), które reagują z endotoksynami.
Ten sposób wytwarzania LAL jest reklamowany jako nieśmiercionośna metoda uzyskiwania krwi od kraba. Ale tak nie jest. Ponieważ nie wszystkie kraby przeżywają!
Według Atlantic State Marine Fisheries Commission, w ich 2019 Horseshoe Crab Stock Benchmark Stock Assessment and Peer Review Report, 600 000 krabów podkowiastych jest chwytanych i wykrwawianych, aby zaspokoić roczne zapotrzebowanie na LAL.
Z tych 600 000 krabów, około 420-540 000 (70-90%) przeżywa procedurę. W połączeniu z ingerencją w siedliska, globalnym ociepleniem i kolejnymi 500 000 + zbieranymi i zabijanymi każdego roku w celu wykorzystania jako przynęta w połowach węgorza i whelk, można zobaczyć, dlaczego populacje kraba podkowiastego gwałtownie spadają.
Nie tylko to, ale kraby są zbierane w maju i czerwcu, kiedy wychodzą na brzeg w dużych ilościach, aby łączyć się w pary, składać jaja i mieć nadzieję, że utrzymają się przy życiu.
To nie jest zrównoważona sytuacja!
Czy są lepsze sposoby na zrobienie LAL?
“Podkowiec amerykański przeżył dinozaury i przetrwał cztery poprzednie masowe wyginięcia, ale teraz jest zagrożony przez przemysł farmaceutyczny, społeczności rybackie, utratę siedlisk, zmiany klimatyczne, a ostatnio przez dławiące pływy czerwonych alg u wschodnich wybrzeży Stanów Zjednoczonych.”Z Jonathana Wattsa w The Guardian
Istnieją dwa główne wysiłki, które są przedstawiane jako sposoby na złagodzenie tej niefortunnej sytuacji.
Jednym z podejść próbowanych przez przemysł farmaceutyczny jest akwakultura krabów podkowiastych.
Początkowo próby hodowli krabów podkowiastych nie były zbyt udane. Wydawało się, że po 3-4 miesiącach hodowli, stężenie białka w hemolimfie spadło do poziomu powodującego śmiertelność. Te zgony były uważane za związane z niedoborami żywieniowymi.
Dr Anthony Dellinger jest profesorem w dziale neurobiologii na University of North Carolina w Greensboro i naukowcem w Kepley Biosystems Incorporated, Greensboro, NC.
Dellinger i KBI ciężko pracowali nad rozwojem nowego, ulepszonego systemu akwakultury. Ich założeniem jest, że “kontrolowane pobieranie LAL od monitorowanych i dobrze utrzymywanych krabów podkowiastych w akwakulturze mogłoby zwiększyć ilości dostarczanego LAL, zapewnić żywotność gatunków i pozwolić na nowe innowacje kliniczne.”
Jeśli się powiedzie, produkcja większych ilości LAL w sposób niezawodny, zrównoważony i ekonomiczny przyniosłaby korzyści zarówno naturze jak i przemysłowi.
Dellinger i współpracownicy opisali szczegółowo, jak działa ich system akwakultury w pracy opublikowanej w Frontiers of Marine Science w kwietniu tego roku.
Przyjrzyjrzyjmy się najważniejszym punktom i wynikom tego badania.
Po pierwsze, zoptymalizowali wewnętrzny recyrkulacyjny system akwakultury, który niezawodnie utrzymuje kraby podkowiaste. Ich celem było ułatwienie powtarzalnych zbiorów LAL przy jednoczesnym utrzymaniu dobrego samopoczucia zwierząt.
Kolejnym kamieniem milowym było osiągnięcie metody dla mało inwazyjnych powtarzalnych zbiorów. Aby tego dokonać, chirurgicznie wszczepili cewnik do podkowca. Wszystkie ich testy wykazały, że podkowce całkiem dobrze tolerowały te cewniki.
Here’s a quick summary of their results.
They harvested and maintained 24 crabs for one year with 100% survival. Kraby podkowiaste były sprawdzane pod kątem aktywności LAL, uwalniania jaj i spermy oraz innych oznak, które mogłyby wskazywać na pogorszenie stanu zdrowia. Nie zaobserwowano takich oznak.
Kraby krwawiły z cewników około trzy razy w miesiącu, co potencjalnie równa się około 36 krwawieniom na kraba w okresie 12 miesięcy. W tym okresie czasu nie napotkano żadnych problemów związanych z wszczepionymi cewnikami.
Kiedy obliczono poniesione koszty, poza początkowym układem systemu akwakultury, utrzymanie krabów wyniosło około 0,76$ na funt, co jest bardzo przystępną kwotą!
Najważniejszym pytaniem, na które należało odpowiedzieć, było:
Jak LAL z utrzymywanych w domu podkowców wypada w porównaniu z LAL uzyskanym ze świeżo zebranych krabów?
Jak pokazano na rycinie 6 w ich pracy, nie było znaczącej różnicy w aktywności koagulacji endotoksyn LAL między akwakulturowanymi i dzikimi krabami. I nie było też żadnej realnej różnicy w aktywności z krwawień pobranych w dniach 1, 16 i 23.
Te wyniki doprowadziły ich do konkluzji,
“…akwakultura mogłaby zaspokoić potrzeby przemysłu przez kilka lat z ekwiwalentem 5-10% rocznego połowu, pozostawiając prawie 600,000 HSC w środowisku naturalnym każdego roku później. W rzeczywistości, ustalenia te sugerują, że ∼60,000 HSC z akwakultury mogłoby być w sposób zrównoważony wykrwawiane 12-24 razy rocznie i przekraczać obecne zapotrzebowanie biomedyczne na LAL.”
Drugie podejście całkowicie eliminuje zapotrzebowanie na kraby.
Jeak Ling Ding, wraz z mężem i partnerem badawczym Bow Ho, w Singapurze, mieli cel – całkowicie wyeliminować zapotrzebowanie na kraby podkowiaste.
Badała Carcinoscorpius rotundicauda, azjatycki gatunek, który był znacznie mniejszy niż podkowce atlantyckie, i nie można było ich zbytnio wykrwawić bez śmierci.
Badania Ding nad LAL doprowadziły do odkrycia, że cząsteczka zwana czynnikiem C była odpowiedzialna za jej działanie krzepiące. Ding wyizolował gen dla czynnika C i użył wirusa, aby wprowadzić go do komórek jelitowych owadów. To zasadniczo zmieniło owady w małe fabryki produkujące czynnik C.
Zmodyfikowane owady wytwarzają wystarczające ilości czynnika C, który może być następnie sprzedawany na rynku jako rekombinowany* czynnik C (rFC) jako realny substytut LAL.
* Note: The word recombinant is a term used in molecular genetics to indicate a gene that has been isolated (cloned) and inserted into another organism's DNA so that organism makes the protein that gene specifies. Using a virus is one of many ways to accomplish this.
Więc teraz, zamiast zbierać lub akwakulturować kraby podkowiaste i wykrwawiać je, mogliby hodować duże ilości owadów i izolować rFC.
Przedsiębiorstwa farmaceutyczne, które używały rFC potwierdziły, że działa on równie dobrze jak LAL, a koszty produkcji są porównywalne.
“Byliśmy po prostu tak chętni jako badacze, tak szczęśliwi, że to działa”, powiedział Ding. “I myśleliśmy, że rekombinowany czynnik C zostanie przyjęty na całym świecie, a krab podkowiasty zostanie uratowany.”
Niestety, rFC napotkał te same przeszkody w absorpcji, co LAL, kiedy został wprowadzony. Chociaż rFC jest na rynku od 2003 roku, to powoli zyskuje na popularności. Jednak stopniowo pokonuje przeszkody stojące na drodze do zatwierdzenia go przez FDA. Początkowo produkował go tylko jeden producent – szwajcarska firma chemiczna Lonza Group.
W 2013 roku Hyglos GmbH stał się drugą firmą produkującą rFC. Kevin Williams, starszy naukowiec w Hyglos, mówi, że widzi przyjęcie i zatwierdzenie rFC jako dawno spóźnione. Firma Hyglos GmbH uzyskała zgodę na jego stosowanie od kilku europejskich agencji regulacyjnych.
Dzisiaj eksperci uważają, że ostatecznie rFC stanie się dominującą metodą wykrywania endotoksyn, pozwalając podkowcom całkowicie zejść z haka produkcji przemysłowej.
Teraz to jest coś, z czym kraby podkowiaste mogą żyć!
Note: In these times of COVID-19, I wouldn't be surprised to see the obstacles removed even faster. Taking and applying research knowledge to improve patient wellbeing is happening faster than ever before. And in cases like this, that's a really good thing!
Co prowadzi nas do ostatniego pytania, na które chcę spojrzeć:
Dlaczego obchodzi nas, czy kraby podkowiaste przeżyją, tak czy inaczej?
Czy nie są one tylko starożytnymi reliktami, bez których nasz nowoczesny ekosystem mógłby się łatwo obejść? Mnóstwo innych gatunków wyginęło, a planeta wydaje się całkiem ok.
To ważne pytanie, więc przyjrzyjmy się mu nieco głębiej.
Odruch kolanowy to odpowiedź “oczywiście, że chcemy je uratować!”. Mamy wystarczająco dużo stworzeń na tej planecie już zagrożonych lub które już wyginęły. Po prostu nie możemy sobie pozwolić na utratę kolejnych.
Jak już powiedziałem, jest to bardziej reakcja jelitowa, a nie odpowiedź, na której możesz zawiesić swój kapelusz. Aby uzyskać lepszą odpowiedź, musimy przyjrzeć się, jak kraby podkowiaste pasują do wielkiego obrazu.
Zacznijmy od tego, co jedzą i co je.
Dorosły krab podkowiasty żeruje na małych mięczakach, takich jak małż błękitny i małż surfingowy, oraz robakach annelid.
Od 2017 r., małże błękitne nie są w poważnym niebezpieczeństwie według tego raportu The Safina Center na Uniwersytecie Stony Brook. To samo dotyczy zarówno annelidów, jak i małży surfingowych.
Juveniles żywią się małymi cząstkami zarówno glonów, jak i materii zwierzęcej. Wraz ze wzrostem rozmiarów zwierzęcia, rośnie również zdobycz, którą konsumuje.
W sumie wygląda na to, że podkowce nie mają żadnego szkodliwego wpływu na swoje ofiary.
Ok, to jedna strona medalu. A co z drugą? Co zjada kraby podkowiaste?
Horseshoe crab eggs are a food source for many organisms.
These include shorebirds, some fish – striped bass, striped killifish, silversides, flounder – as well as sea turtles, crabs, and whelks. Są one krytycznym źródłem pożywienia dla 11 gatunków migrujących ptaków brzegowych. Utrata tych jaj zniszczyłaby te populacje ptaków.
Żółwie morskie loggerhead i ptaki brzegowe, takie jak węzeł czerwony zależą od krabów podkowiastych.
Tysiące tych żółwi migrują do Chesapeake i Delaware Bay w lecie, aby żywić się krabami. Obecnie uważa się, że loggerheads cierpią z powodu braku krabów podkowiastych w Chesapeake.
Kilka anegdot donosi, że kraby podkowiaste pojawiają się w brzuchach aligatorów i rekinów.
Młode kraby podkowiaste mogą być również kluczowym pożywieniem w przybrzeżnej sieci pokarmowej. Przez całe lato i jesień, larwalne i wczesne stadium życia kraby podkowiaste roją się na płyciznach. Te kąski są bez wątpienia pożerane przez ryby i ptaki brzegowe, jak również.
I wygląda na to, że istnieje wiele innych zwierząt, które uważają je za całkiem smaczne i trudno byłoby znaleźć łatwe substytuty.
Jak na stworzenie, które istnieje od 450 milionów lat, nasze rozumienie roli, jaką Limulus polyphemus odgrywa w ekosystemie przybrzeżnym, jest dalekie od kompletności.
Przy obecnym stanie naszej wiedzy na temat ekologii podkowca, nie możemy definitywnie dojść do żadnych wniosków na temat tego, jak istotna jest ich rola. To, co możemy powiedzieć, to że zdecydowanie zajmują niszę, która wymaga poważniejszych badań.
Nawet w ten sposób, schodzę na stronę potrzeby ich zachowania! To jest moja postawa “lepiej być bezpiecznym niż żałować”. Po prostu wiemy zbyt mało, by pozwolić gatunkowi takiemu jak Limulus polyphemus prześlizgnąć się przez palce i zniknąć, jeśli możemy temu zapobiec.
Więc, czy jest coś, co możesz zrobić?
Jeśli zdarza Ci się mieszkać w pobliżu miejsca, gdzie podkowce przychodzą złożyć jaja, łatwo jest się do tego przyłożyć i pomóc. Istnieją programy przerzucania krabów i badania krabów tarłowych, które polegają na wolontariuszach.
I wreszcie, pamiętaj o krabie podkowiastym, kiedy idziesz do lekarza. Wszystko wstrzykiwane lub wszczepiane do naszych ciał jest nadal testowane pod kątem zanieczyszczenia bakteriami Gram-ujemnymi za pomocą LAL wykonanego z krwi kraba podkowiastego.
Do następnego razu
Rich
Hej! Jeśli podobał Ci się ten artykuł to zapisz się do mojego newslettera i otrzymaj darmowy ebook!
Źródła informacji wykorzystane do tego artykułu:
- The Horseshoe Crab
- Horseshoe Crab Aquaculture as a Sustainable Endotoxin Testing Source
- The Role of Horseshoe Crabs in the Biomedical Industry and Recent Trends Impacting Species Sustainability
- The Last Days of the Blue-.Blood Harvest
- The Underwater Secrets of Horseshoe Crabs
- Ten krab może uratować ci życie – jeśli ludzie nie wymażą go pierwsi
- NJ zakończyła zbiory krabów podkowiastych. Czy inne stany powinny zrobić to samo?
- Strona poświęcona krabom podkowiastym, stworzona przez Kaylę Westerlund
- Atlantycki krab podkowiasty
.