Discussion

Ludzka mikrobiota obejmuje ponad tysiąc odrębnych gatunków bakterii i odgrywa ważną rolę w zdrowiu człowieka poprzez promowanie dostarczania składników odżywczych, zapobieganie kolonizacji patogenów oraz kształtowanie i utrzymywanie prawidłowej odporności błon śluzowych. Komensalne bakterie jelitowe zostały ostatnio docenione jako mające prawdziwą symbiotyczną relację z gospodarzem; w ramach tej dużej puli bakterii, suplementy probiotyczne zawierające LAB (tj. Lactobacillus i Bifidobacteria) zostały uznane za mające wiele korzystnych skutków dla zdrowia ludzkiego, takich jak zapobieganie biegunce i nieswoistym zapaleniom jelit lub profilaktyka infekcji układu moczowo-płciowego. Jednakże, nasza wiedza na temat biochemicznych ról, jakie konkretne gatunki i szczepy odgrywają w ludzkim zdrowiu i chorobach jest bardzo ograniczona. W tym badaniu staraliśmy się poszerzyć wiedzę na temat szlaków redukcji azotanów w wybranych, powszechnie występujących gatunkach bakterii kolonizujących ludzkie jelito, stosując warunki in vitro zgodne z dietą bogatą w azotany i poziomem tlenu występującym na powierzchni błony śluzowej przewodu pokarmowego. Główne wyniki naszych badań wskazują, że: 1) E.coli, fakultatywny beztlenowiec, przekształca azotan do azotynów, a następnie do amoniaku, który stopniowo gromadzi się w pożywkach hodowlanych; 2) L.plantarum, bakteria fermentacyjna, hodowana w obecności egzogennego hemu i witaminy K2 przeprowadza podobne procesy; 3) enzymy E.coli generują znaczące NO z azotynów tylko w warunkach beztlenowych; 4) Wszystkie badane kultury LAB generują duże ilości kwasu mlekowego powodując wystarczające zakwaszenie pożywek hodowlanych, aby napędzać dysproporcjonowanie azotynów do NO.

Większość eukariotów czerpie swoją energię głównie poprzez fosforylację oksydacyjną i musi oddychać O2 do tworzenia ATP, jednak wiele bakterii jelitowych, w tym szczepy E.coli K12, mogą używać NO3- jako alternatywnego akceptora elektronów, gdy O2 jest ograniczone, a azotan jest obfity. E.coli reprezentuje modelowego członka Enterobacteriaceae i chociaż rodzina ta stanowi tylko niewielką część mikrobioty jelitowej, jest szczególnie ważna, ponieważ niektóre szczepy mogą powodować choroby. Ostatnio wykazano również, że azotan wytwarzany jako produkt uboczny zapalenia gospodarza może być wykorzystywany przez E. coli podczas oddychania w celu zapewnienia korzyści wzrostu i konkurowania z mikrobami zamieszkującymi okrężnicę, które polegają wyłącznie na fermentacji. L. plantarum jest uważany za bezpieczny probiotyk i jest powszechnie spotykany w przewodzie jelitowym ssaków, jak również w ludzkiej ślinie, gdzie azotany są znane z gromadzenia się do poziomu milimolarnego z powodu cyklu jelitowo-salivary azotanu, który stanowi około 25% całkowitego krążącego azotanu. Bakteria ta prezentuje typową dla rodziny LAB fakultatywną heterofermentatywną ścieżkę, ale w genomie L. plantarum WCFS1 zidentyfikowano niedawno geny kodujące system putative nitrate-reductase (narGHJI), co sugeruje, że jest ona zdolna do wykorzystania azotanu jako akceptora elektronów. Rzeczywiście niedawno opublikowana analiza genetyczna L.plantarum podkreśliła jego ogromne zróżnicowane i wszechstronne zdolności metaboliczne .

W naszych eksperymentach znaczna aktywność reduktazy azotanowej została wykryta zarówno w E.coli, jak i L.plantarum, gdy napięcie tlenu spada z poziomu atmosferycznego w kierunku zera. Przeciwnie, B.longum infantis, tolerancyjny beztlenowiec pochodzący z przewodu pokarmowego niemowląt, nie wykazywał zdolności do redukcji azotanów nawet w wysokich stężeniach. Bifidobakterie stanowią do 90% bakterii przewodu pokarmowego niemowlęcia, a nasze wyniki są zgodne z obserwacją, że ludzkie mleko matki, które prezentuje szczególnie wysoki poziom azotynów, stanowi źródło pokarmowe azotynów przed ustanowieniem mikrobioty językowej i jelitowej zdolnej do redukcji azotanów, które normalnie występują we florze dorosłych.

Na ryc. 1 pokazaliśmy, że kultury E.coli zawierające 5 mM NO3- miały konkurencyjną przewagę wzrostu w odniesieniu do kultur bez dodatku azotanu, a następnie określiliśmy wpływ gradientów tlenu i azotanu na produkcję azotynów i amoniaku. Nasze wyniki wskazują, że około 2,5 mM NO3- przy 4% lub niższym O2 jest wystarczające do indukowania ekspresji enzymów reduktazy azotanowej, a po 24 h znaczna ilość azotynów gromadzi się zarówno wewnątrz komórek E.coli, jak i w podłożu hodowlanym. Szczegółowa analiza molekularna regulacji aktywności enzymatycznej bakterii wykracza poza zakres tego badania, jednak wiadomo, że szczepy E.coli K12 wyrażają trzy molibdenu zawierające reduktazy azotanu i że wolfram może dezaktywować te enzymy poprzez zastąpienie atomu molibdenu w miejscu aktywnym . Stwierdziliśmy, że dodanie 300 μM tlenku wolframu do kultur uprawianych jak w eksperymentach przedstawionych na ryc. 1 prawie całkowicie zniesione tworzenie azotynów (dane nie pokazane). Tak więc uważamy, że molibden zależne reduktazy azotanowe są odpowiedzialne za kluczowy krok w tworzeniu azotynów. Ważne jest również, aby zauważyć, że E.coli, jak również wiele innych gatunków bakterii, są podatne na toksyczność azotynów z powodu tworzenia kompleksów metal-nitrozyl i zminimalizować tę toksyczność przez koordynację indukcji błonowego transportera azotynów i innych enzymów, które pośredniczą redukcji azotynów. Pełny opis enzymów E.coli reduktazy azotanowej i azotynowej oraz operonów regulacji i ekspresji można znaleźć w doskonałych publikacjach Stewarta i Cole’a.

Scieżki redukcji tlenków azotu w ludzkich jelitach

Obecność azotanów i azotynów w dolnym odcinku przewodu pokarmowego zależy od wielu aspektów, w tym rodzajów bakterii zasiedlających jelita i skomplikowanej równowagi między dietą a ścieżkami metabolicznymi tlenków azotu. Jednak endogenna produkcja azotanów z utleniania NO (głównie poprzez reakcję z oksy-hemoglobiną) od dawna uznawana jest za o rząd wielkości większą niż spożycie z dietą, jak wykazano w późnych latach 70-tych, a ostatnio w badaniach z użyciem myszy z niedoborem eNOS. W schematycznym przedstawieniu Rys. 5 podsumowaliśmy związek między bakteryjną denitryfikacją oddechową, redukcją tlenków azotu do amoniaku, endogenną ścieżką syntazy L-argininy/NO i nieenzymatyczną redukcją azotynów do NO. W procesie denitryfikacji (czerwona ramka), azotan jest redukowany do azotu (N2) w czterostopniowym procesie, w którym azotyn, NO i podtlenek azotu są akceptorami elektronów w reakcjach generujących energię. Niedawno udowodniono, że kompletna ścieżka denitryfikacji, prowadząca do produkcji N2, istnieje w ludzkiej płytce nazębnej i chociaż nadal uważa się, że ma ona niewielkie znaczenie u ludzi, spekulujemy, że może ona odgrywać ważną rolę w warunkach bardzo niskiego napięcia tlenowego w obecności azotanów i nie można wykluczyć powstawania N2 w ludzkim jelicie. Denitryfikacja i dysymilacyjna redukcja azotanu do amoniaku (DNRA, niebieska ramka) mają wspólny pierwszy etap redukcji azotanu do azotynu i kilka klas reduktaz azotanowych zostało powiązanych z tą reakcją. W DNRA drugim etapem jest bezpośrednia, sześcioelektronowa redukcja azotanu do amoniaku, która nie dostarcza energii, ale jest dość powszechnym procesem detoksykacji u fakultatywnych bakterii beztlenowych. Sugeruje się, że DNRA stanowi główną drogę metabolizmu azotanów w żwaczu ssaków. W tym badaniu zidentyfikowano amoniak jako produkt redukcji azotanów w bakteriach E.coli i Lactobacillus hodowanych w obecności mM azotanów przy 4% tlenu lub niższych poziomach.

Expand

Odpowietrzna denitryfikacja może również generować małe, ale istotne ilości NO jako produktu pośredniego i została włączona do bakteryjnej produkcji NO w jelicie. Inne możliwe drogi produkcji NO to kwaśna konwersja azotynów (zielona ramka) i utlenianie L-argininy przez enzymy NOS (brązowe kółko). Na Rys. 4C zbadaliśmy zależność protonową nieenzymatycznej dysproporcjonowania azotynów i wykazaliśmy, że staje się ona istotna tylko wtedy, gdy pH wewnątrzkomórkowe lub płynów ustrojowych jest niższe niż 5,5. Nasze wyniki wykluczyły również obecność aktywnych enzymów NOS w E.coli i L.plantarum, jednakże wiadomo, że komórki nabłonka jelitowego produkują NO poprzez ekspresję zarówno śródbłonkowych, jak i indukowalnych izoform NOS. Co ciekawe, produkcja NO w jelitach może być wyzwalana również przez procesy enzymatyczne peroksydaz, które występują obficie na komórkach błony śluzowej jelit i wykazano, że wykorzystują azotyn jako substrat do produkcji NO jako część ich działania antybakteryjnego.

Wierzymy, że wszystkie te różne ścieżki redukcji azotanu mogą współistnieć i występować jednocześnie, jednak jest prawdopodobne, że tylko jeden metabolit będzie dominował w zależności od konkretnych warunków fizjologicznych.

Fizjologiczne znaczenie tworzenia NO przez bakteryjną redukcję azotanów

Dietetyczne azotany i azotyny są nadal przedstawiane jako możliwe substancje toksyczne w wielu badaniach, pomimo rosnącej liczby dowodów, że produkcja NO z tych jonów ma ważne korzystne implikacje dla funkcji sercowo-naczyniowych, immunologicznych i żołądkowo-jelitowych. W jelitach NO służy kilku funkcjom fizjologicznym, takim jak regulacja przepływu krwi przez śluzówkę, ruchliwość jelit i grubość śluzu. Przewlekła nadprodukcja NO jest również związana z nieswoistymi zapaleniami jelit i prawdopodobnie hamuje wzrost wielu różnych gatunków bakterii. Wcześniejsze badania nie wyjaśniły, w jaki sposób bakterie jelitowe produkują NO, jednak Sobko i wsp. wykazali, że w przeciwieństwie do szczurów konwencjonalnych, poziomy NO w jelitach szczurów pozbawionych bakterii są niezwykle niskie, a gdy zaszczepiono im normalną florę bakteryjną, obserwowana produkcja NO wzrosła 10-krotnie.

W naszych eksperymentach stężenia tlenu i protonów określały specyficzną drogę redukcji azotanów do NO. Wyniki przedstawione na Rys. 4A wskazują, że E.coli jest zdolna do enzymatycznej aktywności NO w warunkach beztlenowych przy stężeniach azotanów większych niż 1 mM, prawdopodobnie poprzez denitryfikację lub peryplazmatyczny enzym reduktazy azotynów cytochromu c (Nrf), jak zaproponowali Corker i Poole . Ta generacja NO, jednakże, jest znacznie zmniejszona przy 2% tlenu i staje się niezależna od azotanów. Co ważne, nasze dane są zgodne z doniesieniem Sobko i współpracowników, że E. coli generowała nieznaczne poziomy NO podczas 24-godzinnej inkubacji z 0,1 mM azotanu. LAB produkował znaczne ilości NO w odpowiedzi na zakwaszenie pożywki w wyniku akumulacji kwasu mlekowego. Zastąpienie podłoża wzrostowego świeżym LMRS (pH = 6,5) prawie całkowicie zablokowało zdolność kultur LAB do konwersji azotynów do NO, ale nie u E.coli. Pomiary pH jelit wahają się pomiędzy 5,7 a 7,5, dlatego in vivo dysproporcjonowanie azotynów jest prawdopodobnie niewielkim i zlokalizowanym aspektem produkcji NO. Odwrotnie, ta ścieżka jest dobrze ugruntowanym zjawiskiem w kwaśnym środowisku żołądka (pH około 3).

Podsumowując sugerujemy, że NO generowane przez bakterie jelitowe w pobliżu błony śluzowej jelita może albo wywierać korzystne efekty zauważone powyżej lub na wyższych poziomach, zakłócać te funkcje. Tak więc bakteryjne tworzenie NO w jelitach może być postrzegane jako modulator zarówno fizjologicznych i patologicznych efektów.

Fizjologiczne implikacje bakteryjnego tworzenia amoniaku dla zdrowia

Bakterie jelitowe są znane z produkcji amoniaku z deaminacji aminokwasów lub poprzez ureazę, hydrolizę mocznika do dwutlenku węgla i amoniaku od przełomowych badań Vince et al. na początku lat 70-tych. Ostatnio Cole i współpracownicy podali, że głównym produktem redukcji azotynów w E.coli jest amoniak, przy czym tylko około 1% jest redukowany do NO przy neutralnym pH. Wyniki uzyskane w naszym badaniu sugerują, że przynajmniej niektóre powszechnie występujące bakterie jelitowe redukują azotyny głównie do amoniaku, a nie do NO. U zdrowych osób, w zwykłych warunkach fizjologicznych, większość amoniaku wytwarzanego w dolnym odcinku przewodu pokarmowego jest wydalana do płynów ustrojowych i metabolizowana przez hepatocyty wątroby, gdzie amoniak i dwutlenek węgla są enzymatycznie przekształcane do fosforanu karbamoilu, który wchodzi w serię reakcji zwanych “cyklem mocznikowym”, prowadząc do powstania mocznika i jego eliminacji przez nerki (patrz Rys. 5). Prawidłowe stężenie amoniaku w osoczu mieści się w zakresie 10-35 μM, jednak przy nadmiernej produkcji amoniaku, przenoszony przez krew wrotną amoniak może ominąć wątrobę, prowadząc do hiperamonemii. Amoniak we krwi swobodnie przenika przez barierę krew-mózg, a wysokie stężenia (>100 μM) działają toksycznie na ośrodkowy układ nerwowy, prowadząc do encefalopatii i ostatecznie do śpiączki. Pacjenci z marskością wątroby bardzo często rozwijają encefalopatię wątrobową (HE). W przypadku braku niewydolności wątroby, śpiączka hiperamonemiczna została przypisana sepsie wywołanej przez mikroorganizmy zdolne do ureazy, takie jak Klebsiella pneumonia. Klasyczne metody leczenia HE obejmują zmniejszenie ogólnoustrojowego poziomu amoniaku poprzez antybiotykoterapię (w celu zabicia bakterii produkujących amoniak w jelitach) i podawanie niewchłanialnych cukrów, takich jak laktuloza i laktitol. W jelicie grubym laktuloza jest rozkładana przez bakterie jelita grubego głównie do kwasu mlekowego, a także do niewielkich ilości kwasu mrówkowego i octowego. To zakwaszenie sprzyja tworzeniu się niewchłanialnego jonu amonowego z amoniaku i zmniejsza jego stężenie w osoczu. Nie jest jasne, w jakim stopniu dietetyczny azotan przyczynia się do stężenia amoniaku w jelitach i krwi, jednak proponujemy alternatywną hipotezę, że zwiększone zakwaszenie treści jelita grubego z powodu obecności laktulozy sprzyja konwersji mikrobioty azotynów do NO zamiast amoniaku przez znany mechanizm zależny od kwasu.

Wnioski

Przez ponad 30 lat biologiczny los egzogennego azotanu nie mógł być uwzględniony w wydalanych związkach zawierających azot, które wynoszą około 60% spożytej dawki azotanu u ludzi. Nasze wyniki potwierdzają ideę, że azotan jest przekształcany do azotynów, a następnie do innych zredukowanych biomolekuł azotu, takich jak NO, amoniak, mocznik i prawdopodobnie gaz azotowy przez bakterie w ślinie, żołądku, jelicie cienkim i grubym. Pytania o to, ile amoniaku powstaje w wyniku redukcji azotanów do azotynów, a ile w wyniku innych ważnych procesów, takich jak deaminacja i aktywność bakteryjnych ureazy, wymagają szczegółowych badań metabolicznych na zwierzętach i/lub ludziach. Biologiczne znaczenie przemiany azotanów pokarmowych w świetle jelita nie zostało jeszcze ustalone. Niemniej jednak, tradycyjne diety japońska i śródziemnomorska, o których wiadomo, że mają działanie ochronne na układ krążenia, mają średnie spożycie azotanów na osobę 2-3 razy wyższe niż typowa dieta zachodnia (w Stanach Zjednoczonych odpowiadająca około 40-100 mg/dzień azotanów). Dalsze badania nad związkiem między bakteriami symbiotycznymi, metabolizmem tlenków azotu i zdrowiem człowieka są potrzebne, jednak jasne jest, że biologiczne szlaki metabolizmu azotu u ssaków są bardziej złożone i ważniejsze niż przewidywano nawet kilka lat temu.

.