Cell cycle along the maize primary root
Korzeń pierwotny kukurydzy podzielono na kolejne segmenty, które wskazywały granice czapeczki korzeniowej, strefy wydłużania merystemu wierzchołkowego oraz strefy różnicowania, zgodnie z wcześniejszymi wynikami (Alarcón i in., 2016). Odległość od RCJ do wierzchołka korzenia oszacowano na 457 µm, którą usunięto przed podziałem korzenia na kilka stref. Strefa merystematyczna wierzchołka korzenia (MZ) znajduje się w najbardziej apikalnej części korzenia 1,5 mm od RCJ, a strefa przejściowa (TZ) ciągnęła się do 3 mm. Strefa szybkiego wydłużania (EZ), w której komórki szybko się wydłużają, została wyznaczona na 3-6 mm, a w rejonach oddalonych od 6 mm zaobserwowano, że tempo wydłużania komórek zaczyna spadać, co wskazuje na strefę zakończenia wzrostu (Verbelen i in., 2006). Strefy położone 12-20 mm i 20-30 mm od RCJ to strefy różnicowania (DF), gdzie korzenie boczne rozpoczynają swój rozwój. Podobne przekroje korzeni przeprowadzono u Arabidopsis, gdzie korzeń został podzielony na pięć odcinków, które są krótsze niż te w korzeniu kukurydzy (Cools i in., 2010). Ostatnio doniesiono o zróżnicowanej ekspresji genów wzdłuż korzenia Arabidopsis, a represjonowane lub indukowane geny różnią się głównie w zmianie ze strefy merystematycznej do przejściowej, jak również ze strefy przejściowej do elongacyjnej (Chaiwanon i Wang, 2015).
Granica merystemu korzenia jest określana przez wyjście z cyklu komórkowego i równowagę między podziałem komórek a ich wydłużaniem (Perilli i in., 2012). Profil cytometrii przepływowej pokazuje progresję cyklu komórkowego wzdłuż korzenia pierwotnego, a dane pokazujące liczbę względnych komórek na fazach cyklu komórkowego wskazują na aktywność komórkową w kilku strefach korzenia. Dlatego też, gdy komórki wychodzą z cyklu komórkowego, mogą przestać się cyklizować. Ponadto, ogólnie przyjmuje się, że wyjście komórek z cyklu komórkowego ma miejsce po mitozie, a decyzja o wejściu w nowy cykl komórkowy podejmowana jest w punkcie przejścia G1 do S w odpowiedzi na czynniki wzrostu i różne hormony (Gutierrez i in., 2002; Inzé i De Veylder, 2006; Polyn i in, 2015).
Na Rys. 1 pokazujemy, że w korzeniach 150-160 mm uprawianych w 30°C merystem jest praktycznie ograniczony do MZ, strefy 0-1,5 mm od RCJ, gdzie procent komórek w fazach G0/G1-, S- i G2/M wynosił odpowiednio około 27, 23 i 39 (Tabela 1). Względny czas trwania faz G1, S, G2 i M w merystemie Allium został oszacowany na odpowiednio 26,5, 44,5, 16,5 i 12,5% (Giménez-Martín i in., 1977), a te wartości procentowe są bardzo podobne u innych gatunków. Chociaż nasze wyniki wykazały, że merystem kukurydzy ma niższy procent komórek w fazie S, wartości (23%) były wystarczające, aby wskazać na progresję cyklu komórkowego (Reichheld i in., 1999). Te względne proporcje uległy wyjątkowej zmianie, gdy analizowano TZ w tej strefie. Odsetki te wynosiły 9, 10 i 68%, odpowiednio dla faz G0/G1, S i G2/M. Wynik ten sugeruje, że komórki zaczęły opuszczać cykl komórkowy. Wynik ten sugeruje, że komórki zaczęły wychodzić z cyklu komórkowego, gdy znalazły się w odległości 1,5 mm od RCJ. Dodatkowo, wartości procentowe w EZ sugerują, że przy 3 mm komórki są poza cyklem komórkowym (Rys. 1, Tabela 1). Ponadto, spadek odsetka komórek w fazach G0-G1- i S był kompensowany wzrostem w fazie G2-M (tab. 1, ryc. 2). Wyniki te wyraźnie wskazują, że komórki zatrzymują cykl komórkowy, gdy znajdują się w fazie G2.
Rozkład populacji komórek w kilku fazach cyklu komórkowego wzdłuż wierzchołka korzenia. Korzenie były uprawiane hydroponicznie w temperaturze 30°C do osiągnięcia 150-160 mm długości. Dane pochodzą z pojedynczego, reprezentatywnego eksperymentu, w którym użyto co najmniej 10 000 komórek do oszacowania procentowego udziału w różnych odległościach od RCJ. Eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach.
Tabela 1.
Wpływ temperatury na cykl komórkowy w kilku strefach wierzchołka korzenia kukurydzy
Wpływ temperatury na cykl komórkowy wzdłuż wierzchołka korzenia kukurydzy. Histogramy częstości zawartości DNA w komórkach z kilku segmentów wierzchołka korzenia kukurydzy uprawianej w temperaturze 20°C i 30°C. Lewa kolumna przedstawia histogramy z korzeni uprawianych w temperaturze 30°C, prawa kolumna z korzeni uprawianych w temperaturze 20°C. Korzenie zostały podzielone na kilka segmentów: 0-1,5 mm (A,G); 1,5-3 mm (B,H); 3-6 mm (C,I); 6-12 mm (D,J); 12-20 mm (E,K) i 20-30 mm (F,L). Dane pochodzą z pojedynczego, reprezentatywnego eksperymentu z użyciem co najmniej 10 000 komórek. Eksperymenty wykonano w trzech egzemplarzach.
Donoszono, że większość typów komórek opuszcza merystem w fazie G1, a ostatnio przejście G1-to-S jest wyzwalane tylko w komórkach perycyklu w celu zainicjowania korzenia bocznego (Vanneste i in., 2007). W perycyklu Arabidopsis zaproponowano, że komórki przylegaj±ce do biegunów protoxilemu, przechodz±c przez strefy przej¶cia, wydłużenia i różnicowania, bez przerwy kontynuuj± cykl komórkowy (Dubrovsky i in., 2008). Komórki te s± jedynymi, które dziel± się, aby zapocz±tkować primordia korzenia bocznego. Natomiast pozostałe komórki tworz±ce korzeń nie dziel± się. Zatem komórki epidermy i kory, które stanowią większość tkanek korzenia, nie kontynuują cyklu, gdy opuszczają merystem korzenia.
W naszej analizie zaobserwowaliśmy znaczący wzrost liczby komórek w fazie G2 w TZ i EZ. Wynik ten sugeruje, że komórki opuszczające merystem w fazie G2 nie ulegają mitozie, ale zatrzymują się w tej fazie G2 i w niej pozostają. Spekulujemy, że komórki opuszczające merystem w fazie G1- lub S kontynuują cykl komórkowy do fazy G2, gdzie się zatrzymują. Wynika to z obserwacji, że spadek odsetka komórek w G0/G1 pomiędzy MZ i TZ (29,7%) jest kompensowany wzrostem w G2 (28,8%) (tab. 1, ryc. 2). Słabe obniżenie odsetka komórek w G2 następuje pomiędzy EZ a bazalnym końcem DZ (20-30 mm od RCJ). To niewielkie zmniejszenie, wraz ze zmniejszeniem liczby jąder hiperploidalnych, jest kompensowane przez zwiększony poziom hipoploidów (tab. 1).
Z drugiej strony, doniesiono, że TZ w korzeniu wierzchołkowym kukurydzy nie są zaangażowane w podziały mitotyczne, a w tej strefie jądra postmitotyczne znajdują się w centralnej pozycji w komórce (Baluška i in., 2001). Ponadto, wzdłuż strefy korzeniowej nie zaobserwowano figur mitotycznych; inicjację primordiów korzeni bocznych obserwowano w odległości 20-25 mm od RCJ (Alarcón i in., 2016). U Arabidopsis średnia odległość do najwcześniejszej mitozy w perycyklu wynosi 3194 µm, a pierwszą mitozę zaobserwowano w odległości 2205 µm od wierzchołka korzenia (Dubrovsky i in., 2001). W korzeniu kukurydzy, dopiero w odległości 20-30 mm od RCJ, niektóre komórki perycyklu przeciwległego do ksylemu wykazywały skondensowaną cytoplazmę, co wskazuje na ich ponowne wejście w cykl komórkowy (Alarcón i in., 2016). Różnice te mogą być spowodowane większym tempem elongacji korzenia u kukurydzy, która rośnie 80-90 mm/dzień, podczas gdy Arabidopsis elonguje tylko 10 mm/dzień (Dubrovsky i in., 2001).
Wykazano przy użyciu specyficznej dla danej tkanki ilościowej analizy mikroskopowej, że niektóre komórki kory i epidermy były w pierwszym endocyklu (zawartość DNA pomiędzy 4C a 8C) w momencie ich rozpoczęcia elongacji. Ponadto, j±dra elementów metaksymalnych w strefie przej¶ciowej, w momencie rozpoczynania się ich szybkiego wydłużania, przechodziły jeden lub dwa endocykle, osi±gaj±c 32C (Baluška, 1987, 1990; Baluška i Kubica, 1984; Baluška i in., 1995). Ostatnio opisano, że endoreduplikacja zachodzi u roślin przed rozpoczęciem różnicowania się komórek (De Veylder i in., 2007). Nie zaobserwowaliśmy jednak odpowiedniej liczby jąder o poziomie ploidalności wyższym niż 4n. Ponadto, gdyby endoreduplikacja była powszechnym procesem w wierzchołkach korzeni kukurydzy, spodziewalibyśmy się wzrostu hiperploidalności w miarę analizowania stref bardziej oddalonych od RCJ. Jednak hiperploidalność nie tylko nie wzrosła w strefach wydłużania, ale wręcz zmalała (Tabela 1).
Donoszono, że komórki perycyklu pozostają w fazie G1 do czasu ponownego wejścia w cykl komórkowy (Vanneste i in., 2007). Jednakże komórki perycyklu stanowią jedynie niewielki ułamek całkowitej liczby komórek tworzących wierzchołki korzeni; komórki epidermy i kory są najbardziej licznymi typami komórek w wierzchołku korzenia. Skoro więc około 70% wszystkich komórek opuszcza merystem w fazie G2, to większo¶ć komórek epidermy i kory musi być w fazie G2, gdy opuszczaj± merystem. Przyjmuje się, że elongacja komórek epidermy i kory kontroluje wzrost podłużny korzenia (Alarcón i in., 2014b). Dlatego komórki zaangażowane w proces różnicowania, którego efektem jest wydłużenie korzenia, powinny znajdować się w fazie G2.
.