RESULTS AND DISCUSSION
An A375 melanoma cell line with a constitutively activated MAPK due to a BRAFV600E mutation was treated with MEK inhibitor U0126 at a concentration of 25 μM for 8 h, resulting in the suppression of the ERK phosphorylation (Fig. 1 a). Poziom mRNA rozpuszczalnych czynników immunosupresyjnych, w tym IL-6, IL-10 i VEGF, uległ znacznemu obniżeniu pod wpływem leczenia U0126 (ryc. 1 b), podczas gdy kontrolne leczenie DMSO nie wpłynęło na produkcję mRNA IL-10 i VEGF, a jedynie nieznacznie zwiększyło poziom mRNA IL-6. 18-godzinna ekspozycja na U0126 hamowała również produkcję IL-10, VEGF i IL-6 na poziomie białka, wskazując, że aktywowane ERK mogą być odpowiedzialne za tłumienie lokalnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko czerniakowi poprzez produkcję tych czynników immunosupresyjnych (ryc. 1 c). Ponadto, supresja fosforylacji ERK i hamowanie produkcji IL-6, IL-10 i VEGF występowały nawet po zmniejszeniu stężenia leczenia U0126 do 10 μM (nie przedstawiono). Podczas tego badania nie zaobserwowano znaczących efektów cytotoksycznych przy traktowaniu U0126 komórek A375. Chociaż wiadomo, że U0126 hamuje MEK5 oprócz MEK1/2, fosforylowana ERK5, substrat MEK5, nie została wykryta w komórkach A375 (nie przedstawiona), wskazując, że ścieżka MEK1/2-ERK1/2 jest odpowiedzialna za efekty obserwowane przy leczeniu U0126. Działanie supresyjne U0126 na produkcję IL-10 i VEGF wykazano również w trzech innych liniach komórkowych czerniaka z mutacją BRAFV600E, 624mel, 888mel i 928mel, bez znaczącej toksyczności komórkowej (ryc. 1 d). Ponieważ te linie komórkowe czerniaka nie produkują IL-6, aktywowana sygnalizacja MAPK wydaje się mieć ogólną rolę w produkcji czynników immunosupresyjnych IL-10 i VEGF w liniach komórkowych czerniaka BRAFV600E+.
Zmniejszona produkcja immunosupresyjnych rozpuszczalnych czynników IL-6, IL-10, i VEGF z linii komórkowych czerniaka z konstytutywnie aktywną MAPK przez mutację BRAFV600E przez hamowanie sygnalizacji MAPK inhibitorem MEK, U0126. (a) Zahamowanie fosforylacji ERK1/2 wykryto za pomocą analizy Western blot linii komórkowej czerniaka A375mel z mutacją BRAFV600E przed oraz 2, 4, 6 i 8 h po leczeniu inhibitorem MEK, U0126 w stężeniu 25 μM. (b) Zahamowanie ekspresji mRNA dla rozpuszczalnych czynników immunosupresyjnych IL-6, IL-10 i VEGF w komórkach A375. MRNA dla różnych rozpuszczalnych czynników, w tym IL-6, IL-10, i VEGF, mierzono ilościowym RT-PCR przed i 2, 4, 6, i 8 h po leczeniu U0126. Leczenie kontrolne przeprowadzono przy użyciu roztworu DMSO. Poziomy mRNA w każdym punkcie czasowym zostały znormalizowane do mRNA GAPDH i wskazane jako wartość względna do wartości z 0 h. (c) Zmniejszona produkcja białek IL-6, IL-10 i VEGF z komórek A375 po 18-h traktowaniu U0126 w stężeniu 25 μM. Ekspresja została wykryta metodą ELISA z supernatantami hodowli. Stosunek żywotności komórek traktowanych U0126 do komórek traktowanych DMSO wynosił 77%. Produkcja cytokin została znormalizowana do wartości komórek kontrolnych traktowanych DMSO na podstawie liczby komórek. Western blot wykazał silne zahamowanie fosforylacji ERK, ale nie białka STAT3, ani jego fosforylacji przy Ser727 i Tyr705. (d) Zmniejszona produkcja IL-10 i VEGF z trzech linii komórkowych czerniaka z mutacją BRAFV600E, 624mel, 888mel i 928mel po 18-godzinnym leczeniu U0126 w stężeniu 25 μM, co wykryto metodą ELISA z supernatantami hodowli. Stosunek żywotności komórek poddanych działaniu U0126 do komórek poddanych działaniu DMSO podczas zbioru wynosił 95% dla 624mel, 103% dla 888mel i 100% dla 928mel. Produkcja cytokin została znormalizowana do wartości komórek kontrolnych traktowanych DMSO na podstawie liczby komórek. Western blot wykazał silne zahamowanie fosforylacji ERK, ale nie białka STAT3. Nieznaczne obniżenie fosforylacji Ser727 białka STAT3 zaobserwowano w komórkach 888mel i 928mel, ale nie w komórkach 624mel. Wyniki te są reprezentatywne dla trzech lub czterech niezależnych eksperymentów z podobnymi wynikami.
Jednakże niespecyficzny wpływ U0126 na produkcję cytokin poprzez szlaki inne niż sygnalizacja MAPK nie może być całkowicie wykluczony na podstawie tych eksperymentów z powodu obserwowanego nieznacznego spadku fosforylacji STAT3 przy Ser727 w komórkach 888mel i 928mel (Fig. 1 d). Aby potwierdzić rolę aktywacji MAPK spowodowanej mutacją BRAFV600E w produkcji IL-10, VEGF i IL-6, specyficzne dla BRAFV600E RNAi zostało poddane transfekcji w trzech liniach komórkowych czerniaka, A375, 888mel i 624mel, przy użyciu lentiwirusa wyrażającego specyficzne dla BRAFV600E krótkie RNA szpilkowe (shRNA) (11). RNAi specyficzne dla BRAFV600E znacząco hamowało produkcję IL-10, VEGF i IL-6, jak również tłumiło fosforylację ERK (ryc. 2). Wyniki te potwierdzają, że hamowanie tych czynników przez U0126 (ryc. 1) jest skorelowane ze specyficznym hamowaniem szlaku MAPK. Wyniki te są zgodne z ostatnimi pracami wykazującymi indukowaną przez ERK1/2 produkcję IL-10 w makrofagach myszy (12) i zależną od BRAFV600E produkcję VEGF w celu promocji angiogenezy (13).
Zmniejszona produkcja czynników immunosupresyjnych IL-6, IL-10 i VEGF z trzech linii komórkowych czerniaka z mutacją BRAFV600E przez BRAFV600E-specific RNAi. Trzy linie komórkowe czerniaka z mutacją BRAFV600E, A375mel, 888mel i 624mel, zostały zainfekowane wektorami lentiwirusowymi kodującymi krótkie RNA szpilkowe dla mRNA lucyferazy firefly’a (GL3B; jako kontrola) lub mRNA BRAFV600E (BRAF#1′) przy 50 lub 100 krotności infekcji. W 5 lub 6 dniu po infekcji ekstrahowano białka i poddawano je analizie Western blot. Zaobserwowano głębokie zmniejszenie fosforylacji ERK1/2 przy jednoczesnym zmniejszeniu ilości białka BRAF przez RNAi specyficzne dla BRAFV600E. Nie zaobserwowano istotnych różnic w stężeniu białka STAT3 i fosforylacji STAT3 przy Ser727 lub Tyr705. Niewielkie obniżenie fosforylacji przy Ser727 zaobserwowano w komórkach 888mel i 624mel po zastosowaniu BRAF RNAi. 5 lub 6 d po infekcji lentiwirusem, równą liczbę komórek czerniaka dozowano w gęstości 1-2 × 106 komórek/2 ml, a supernatanty hodowli po 18 h poddawano testowi ELISA na obecność IL-6, IL-10 lub VEGF. Zaobserwowano głębokie zmniejszenie stężenia IL-6, IL-10 i VEGF. Przedstawiono jeden reprezentatywny wynik dwóch lub trzech niezależnych eksperymentów z podobnymi wynikami.
Ponieważ aktywowana sygnalizacja STAT3 została określona jako skutkująca immunologicznym unikaniem raka poprzez produkcję różnych czynników, w tym VEGF (8, 9), zbadaliśmy związek pomiędzy ścieżkami MAPK i STAT3 w odniesieniu do produkcji czynników immunosupresyjnych w linii komórkowej czerniaka A375. Produkcja IL-6, IL-10 i VEGF została dogłębnie zahamowana przez RNAi ukierunkowane albo na sam BRAFV600E, albo na sam STAT3 (ryc. 3 a). Nie zaobserwowano wyraźnego efektu addytywnego lub synergistycznego przy jednoczesnym ograniczeniu szlaków BRAF-MAPK i STAT3 (ryc. 3 a). BRAFV600E RNAi w komórkach A375 nie zmniejszyło aktywności wiązania STAT3 z DNA (ryc. 3 b), aktywności promotora STAT3 (ryc. 3 c) ani fosforylacji STAT3 w pozycji Ser727 lub Tyr705 (ryc. 2), chociaż donoszono, że ERK mogą potencjalnie fosforylować STAT3 w pozycji Ser727 (14). Jednakże fosforylacja STAT3 może również zachodzić na drodze niezależnej od ERK (15). W komórkach 624mel, pomimo niewielkiego spadku fosforylacji STAT3 na poziomie Ser727, aktywność wiązania DNA (ryc. 3 b) oraz aktywność promotora STAT3 (ryc. 3 c) nie zostały zmienione przez BRAFV600E RNAi (ryc. 2). W komórkach 888mel obserwowano podobny spadek fosforylacji Ser727, ale odwrotnie, zarówno aktywność wiązania STAT3 z DNA (ryc. 3 b), jak i aktywność promotora STAT3 (ryc. 3 c) zmniejszyły się po zastosowaniu BRAFV600E RNAi (ryc. 2). Wyniki te sugerują, że zmniejszenie aktywności transkrypcyjnej STAT3 nie jest głównym mechanizmem generującym supresję czynników immunosupresyjnych poprzez wyciszenie sygnalizacji MAPK w tych liniach komórkowych czerniaka.
Zahamowanie produkcji IL-6, IL-10 i VEGF w komórkach A375 poprzez RNAi dla samego BRAFV600E, samego STAT3 lub obu, bez znaczących zmian w aktywności wiązania DNA i aktywności promotorowej STAT3. (a) Głębokie zahamowanie produkcji IL-6, IL-10 i VEGF w komórkach A375 przez RNAi dla samego BRAFV600E, samego STAT3 lub obu. 5 lub 6 d po infekcji, równa liczba komórek była dozowana w gęstości 106 komórek/2 ml, a supernatant z hodowli po 18 h był poddawany testowi ELISA na IL-6, VEGF i IL-10. Obniżenie poziomu BRAF i fosforylowanej ERK1/2 przez RNAi specyficzne dla BRAFV600E oraz obniżenie poziomu STAT3 przez RNAi specyficzne dla STAT3 potwierdzono analizą Western blot. Pokazano jeden reprezentatywny wynik z sześciu niezależnych eksperymentów z podobnymi wynikami. (b) Brak istotnej zmiany aktywności wiązania STAT3 z DNA w wyniku hamowania sygnalizacji MAPK za pomocą BRAF RNAi w liniach komórkowych czerniaka. Aktywność wiązania STAT3 z DNA badano metodą EMSA ekstraktów jądrowych z linii komórkowych czerniaka poddanych działaniu kontrolnego GL3B lub wektora BRAF#1′ shRNA. Specyficzne pasma STAT3 oznaczone strzałkami znikały w przypadku zimnej sondy DNA STAT3 typu dzikiego (wt), ale nie w przypadku zmutowanej sondy DNA STAT3 (mt). W komórkach 888mel zaobserwowano jedynie niewielki spadek aktywności wiązania STAT3 z DNA. (c) Testy reporterowe STAT3 w komórkach A375, 624mel i 888mel. 2-4 × 105 komórek z infekcją wektorem kontrolnym lub wektorem BRAF#1′ shRNA poddano transfekcji 0,4 μg pSTAT3-TA-Luc i 0,4 μg pRL-SV40 za pomocą odczynnika Effectene Transfection Reagent. Po 24 h od transfekcji komórki były zbierane i analizowane pod kątem aktywności lucyferazy firefly i renilla. Każda aktywność lucyferazy firefly została znormalizowana z aktywnością lucyferazy renilla. Zacienione słupki i słupki błędów oznaczają odpowiednio średnią i odchylenie standardowe z trzech powtórzeń testu. Przedstawiono jeden reprezentatywny eksperyment z trzech lub czterech niezależnych eksperymentów. Transkrypcja napędzana przez STAT3 nie uległa zmianie po zastosowaniu BRAF RNAi w A375 i 624mel, ale nieznacznie zmniejszyła się w 888mel.
Następnie zbadano potencjalny wpływ rozpuszczalnych czynników indukowanych przez sygnalizację MAPK i STAT3 w supernatancie z hodowli A375 na dojrzewanie DCs. Supernatant z hodowli komórek czerniaka A375 zawiera rozpuszczalne czynniki, które hamują dojrzewanie ludzkich monocytarnych DC (MoDC) po stymulacji ligandami receptora Toll-podobnego, takimi jak LPS. Dodanie supernatantów z hodowli A375 do hodowli MoDC w końcowym stężeniu 10-20% znacząco zmniejszyło produkcję cytokin zapalnych, w tym IL-12 i TNF-α, w MoDC, jak również cząsteczek powierzchni komórkowej CD1a i CD83, ale nie CD80, CD86, CD40 lub HLA-DR na MoDC. Supernatanty z pozostałych trzech linii komórkowych czerniaka dawały takie same wyniki po dodaniu do hodowli MoDC (nie przedstawiono). Aktywność supernatantów z komórek czerniaka wynika z produkcji IL-6, IL-10 i VEGF, ponieważ dodanie specyficznych przeciwciał dla tych czynników zmniejszyło aktywność supernatantów z hodowli A375 (ryc. 4 a). Rozbieżności pomiędzy naszymi obserwacjami a wcześniej opisanymi wynikami dotyczącymi supernatantu z komórek czerniaka mysiego B16 z aktywowanym STAT3 hamującym ekspresję MHC klasy II i CD40 mogą być tłumaczone różnymi komórkami nowotworowymi lub gatunkami (8).
Zmniejszona aktywność supernatantów hodowli czerniaka A375 przez wstępne traktowanie RNAi dla samego BRAFV600E, samego STAT3 lub obu na indukowaną LPS produkcję IL-12 i TNF-α z DCs. (a) Neutralizacja IL-6, IL-10, lub VEGF w supernatantach hodowli komórek czerniaka A375 przywracała hamowanie produkcji IL-12 z ludzkich DCs stymulowanych LPS. Ludzkie MoDCs hodowano z supernatantami A375 w obecności lub nieobecności przeciwciała monoklonalnego dla IL-6, IL-10, VEGF lub izotypowego przeciwciała kontrolnego w stężeniu 1 μg/ml. Produkcję IL-12 w supernatantach hodowli określono metodą ELISA 24 h po stymulacji LPS w stężeniu 100 ng/ml. (b) Monocyty CD14+ izolowano z PBMCs metodą MACS i hodowano w podłożu zawierającym RPMI 1640, 10% (vol/vol) FBS, 100 ng/ml GM-CSF, i 50 ng/ml IL-4 z lub bez 20% (vol/vol) supernatantu hodowli komórek A375mel przygotowanych w Fig. 3. (a) Połowę pożywki, cytokin i supernatantu hodowli zmieniano co 2 d. W 5. dniu hodowli dodawano LPS w stężeniu 100 ng/ml. Po 15 h zbierano supernatanty hodowli i poddawano je testowi ELISA na IL-12 i TNF-α.
Aktywność supernatantów hodowli A375 na produkcję IL-12 i TNF-α przez MoDCs poddane działaniu LPS została przywrócona przez wstępne traktowanie komórek A375 za pomocą RNAi skierowanego przeciwko samemu BRAFV600E, samemu STAT3 lub zarówno BRAFV600E, jak i STAT3 (ryc. 4 b). Chociaż wydaje się, że RNAi STAT3 zmniejszał aktywność supernatantów hodowli A375 bardziej niż RNAi BRAFV600E, różnica ta może być spowodowana po prostu różną aktywnością RNAi. Należy jednak zauważyć, że nie zaobserwowano addytywnych i synergistycznych efektów RNAi skierowanych jednocześnie przeciwko BRAF i STAT3, co ponownie wskazuje na istotną rolę obu szlaków sygnałowych w produkcji czynników supresyjnych w dojrzewaniu DC. Mimo, że odnotowano aktywację DC przez supernatant z mysiej linii komórkowej raka jelita grubego CT26 transfekowanej dominującą-ujemną formą STAT3, prawdopodobnie poprzez zwiększoną produkcję cytokin prozapalnych, w tym badaniu nie zaobserwowano aktywacji DC. Można to tłumaczyć niepełnym zahamowaniem BRAF i STAT3, brakiem zwiększonej produkcji cytokin prozapalnych w komórkach czerniaka transfekowanych BRAF shRNA lub różnicami w komórkach nowotworowych czy gatunkach.
Podsumowując, po raz pierwszy wykazaliśmy istotną rolę sygnalizacji MAPK wraz ze ścieżką STAT3 w produkcji różnych czynników immunosupresyjnych w liniach komórkowych czerniaka z konstytutywnie aktywną MAPK z powodu wspólnej mutacji BRAFV600E. Tak więc szlak MAPK może być potencjalnie znaczącym celem molekularnym dla przezwyciężenia unikania immunologicznego różnych nowotworów, ponieważ jest on często aktywowany w kilku typach nowotworów, w tym w czerniaku bez mutacji BRAFV600E (16, 17).
.