Głównym celem tej procedury jest sekwencyjna ekstrakcja RNA i DNA z archiwalnych, utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie rdzeni tkankowych. Jest to protokół do pobierania rdzeni tkankowych, z których będziemy ekstrahować zarówno RNA jak i DNA. Główną zaletą tego protokołu jest to, że poprawia on wydajność RNA i DNA z precyzyjnie ukierunkowanych regionów w bloku tkanki.

Procedura ta została w dużej mierze opracowana w archiwalnych tkankach raka prostaty. Może być również stosowana do innych rodzajów tkanek archiwalnych. Wizualna demonstracja tej metody jest krytyczna, ponieważ etapy pobierania tkanki nie są powszechnie stosowane w laboratoriach badawczych.

Większość laboratoriów badawczych stosuje zamiast tego przekroje poprzeczne, które szybciej wyczerpują tkanki i dodają znaczną heterogeniczność do próbki. Rozpocznij od przejrzenia szkiełka mikroskopowego i obrysowania regionu zainteresowania za pomocą markera permanentnego o drobnym punkcie. Następnie, wyciąć odcinek folii parafinowej wystarczająco duży, aby pokryć region zainteresowania na szkiełku mikroskopowym.

Następnie, umieścić folię mocno na szkiełku, owijając folię na krawędziach, aby się nie zsuwała. Używając markera permanentnego o drobnym punkcie, obrysować całą tkankę i interesujący nas region w obrębie tkanki. Następnie zdejmij folię ze szkiełka i przenieś ją do odpowiedniego bloku tkanek.

Orientuj folię, odwracając lub obracając ją tak, aby zarys całej tkanki odpowiadał obserwowanemu kształtowi tkanki w bloku. Mocno docisnąć fragment folii do powierzchni bloczka, aby zapobiec ześlizgnięciu się. Używając końcówki permanentnego markera, wykonać płytkie, ale widoczne wgłębienia wzdłuż konturu regionu zainteresowania, a następnie usunąć folię.

Następnie oczyścić nakłuwacz receptora z zestawu nakłuwaczy 0,6 milimetra, zanurzając końcówkę w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówki zawierającej jeden mililitr wybielacza i przesuwając nakłuwacz w górę i w dół kilka razy. Powtórzyć płukanie w probówce zawierającej 70-procentowy etanol, a następnie wodę. Teraz wcisnąć oczyszczony nakłuwacz w obszar zainteresowania na głębokość trzech milimetrów i wycofać.

Uwolnić rdzeń do probówki mikrowirówkowej o niskiej zawartości substancji wiążących, wypychając go z nakłuwacza za pomocą rysika. Dodać jeden mililitr ksylenu do probówek mikrowirówkowych zawierających rdzenie tkankowe i energicznie worteksować przez dziesięć sekund. Następnie umieścić w bloku cieplnym ustawionym na 50 stopni Celsjusza na trzy minuty.

Po inkubacji, wirować przez dwie minuty w temperaturze pokojowej z maksymalną prędkością. Po odwirowaniu, umieścić rdzenie w lodzie na pięć minut w celu zestalenia pozostałości woskowych. Następnie ostrożnie usunąć parafinę, która nagromadziła się wokół łąkotki wraz z supernatantem za pomocą końcówki pipety.

Potem powtórzyć obróbkę ksylenem. Po usunięciu mieszaniny parafiny z ksylenem dodać jeden mililitr 100-procentowego etanolu i energicznie worteksować przez dziesięć sekund. Po wirowaniu przy maksymalnej prędkości przez dwie minuty, ostrożnie odrzucić etanol.

Powtórzyć płukanie etanolem jeszcze raz przed rozpoczęciem homogenizacji. Przed homogenizacją ponownie zawiesić zdeparafinowane rdzenie w 700 mikrolitrach 100-procentowego etanolu. Użyj zmotoryzowanego homogenizatora tkanek na średnim ustawieniu, aby rozdrobnić rdzenie na drobne cząstki.

Dokładna homogenizacja rdzeni tkankowych jest wymagana dla optymalnej wydajności DNA i RNA. Następnie należy napełnić oddzielne 15-mililitrowe probówki około dziesięcioma mililitrami wybielacza, roztworem neutralizującym RNazę i 70-procentowym etanolem. Po homogenizacji próbki, umyć sondę homogenizatora w każdym z roztworów czyszczących w kolejności.

Podczas etapu mycia uruchomić homogenizator na najwyższej prędkości. Przetrzeć sondę chusteczką i pozostawić do całkowitego wyschnięcia przed homogenizacją następnej próbki. Sprawdzić wzrokowo, czy na ostrzach sondy nie ma resztek tkanki, a w razie ich znalezienia ponownie wyczyścić sondę.

Po homogenizacji doprowadzić objętość próbki do jednego mililitra za pomocą 100-procentowego etanolu, a następnie wirować z maksymalną prędkością przez 15 minut. Ostrożnie odessać etanol i wysuszyć osady na powietrzu przez około 15 do 20 minut przed rozpoczęciem ekstrakcji proteinazą K. Zawiesić ponownie osady w 150 mikrolitrach buforu trawiącego proteinazę K i przeciągnąć probówki, aby poluzować osady.

Nocne trawienie proteinazą K jest zalecane dla większego odzysku DNA. Dodać 10 mikrolitrów stabilnej temperaturowo proteinazy K i wymieszać przez przerzucanie. Inkubować w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 15 minut z łagodnym mieszaniem.

Inkubować probówki na lodzie przez trzy minuty. Po schłodzeniu, odwirować probówkę przez 15 minut z maksymalną prędkością. Następnie, nie naruszając osadu, ostrożnie przenieść każdy supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej do oczyszczania RNA.

Wyekstrahować RNA i DNA stosując zoptymalizowaną procedurę w protokole pisemnym, która obejmuje wydłużony czas trawienia tkanki do ekstrakcji DNA. RNA i DNA można odzyskać ze starszych utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie próbek tkanek przy użyciu tej metody. Kwasy nukleinowe były współekstrahowane z próbek raka prostaty w zakresie od trzech do 14 lat w wieku próbki.

Średnia wydajność wynosiła 2, 270 nanogramów RNA i 820 nanogramów DNA. Co ciekawe, nie było znaczącej korelacji między wiekiem próbki tkanki a odzyskiem kwasów nukleinowych. Ogólnie rzecz biorąc, wydajność RNA i DNA była skorelowana w różnych próbkach, chociaż w większości przypadków ponad dwukrotnie więcej RNA zostało odzyskane w stosunku do DNA.

Aby zademonstrować wydajność genomowego DNA wyodrębnionego za pomocą tego protokołu, ekstrakty DNA przekształcone bisulfitem z archiwalnych próbek raka prostaty zostały amplifikowane przez PCR specyficzne dla metylacji. Elementy repetytywne ALU zostały użyte jako kontrola metylacji i wykazały niewielkie różnice pomiędzy próbkami. GSTP1, gen, o którym wiadomo, że jest hipermetylowany w raku prostaty, nie wykazał wykrywalnej amplifikacji metodą PCR specyficzną dla metylacji, gdy użyto DNA wyekstrahowanego z łagodnych próbek.

Próbki DNA od pacjentów z agresywnym rakiem prostaty wykazywały wykrywalne wartości progowe cyklu QPCR, które były niższe niż te z komórek łagodnego raka prostaty, co wskazuje na zwiększoną metylację GSTP1 w agresywnym raku prostaty. Po opanowaniu, technika ta może być wykonana w ciągu trzech do czterech godzin dla RNA, a po całonocnym trawieniu, w ciągu czterech godzin dla DNA, jeśli jest wykonana prawidłowo. Technika ta powinna umożliwić naukowcom zajmującym się patologią molekularną badanie diagnostycznych biomarkerów DNA i RNA w różnych nowotworach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować rdzenie tkankowe do ekstrakcji DNA i RNA z precyzyjnie odwzorowanych obszarów zainteresowania w archiwalnych blokach tkankowych.