ABSTRACT

Analiza ekspresji genów jest powszechnym narzędziem badawczym służącym do badania sieci kontrolujących ekspresję genów, roli genów o nieznanej funkcji oraz odpowiedzi organizmów indukowanych środowiskowo. Większość narzędzi analitycznych stosowanych do analizy ekspresji genów opiera się na dokładnej syntezie i kwantyfikacji cDNA w celu uzyskania powtarzalnych i wymiernych wyników. Jak dotąd, większość komercyjnych zestawów do izolacji i oczyszczania cDNA jest przeznaczona dla cząsteczek dwuniciowych, które nie odzwierciedlają dokładnie obfitości transkryptów. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy prostą i szybką metodę oczyszczania jednoniciowego cDNA, charakteryzującą się wysoką czystością i wydajnością. Metoda ta oparta jest na traktowaniu RNazą H i RNazą A po syntezie cDNA, a następnie rozdzieleniu w krzemionkowych spin-kolumnach i wytrąceniu etanolu. Ponadto, metoda ta pozwala na uniknięcie stosowania DNazy I do eliminacji genomowego DNA z preparatów RNA, co poprawia wydajność cDNA. W opisie przypadku nasza metoda okazała się przydatna w oczyszczaniu jednoniciowego cDNA z patogenicznego grzyba Sporothrix schenckii.