Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and its management

Rak jest chorobą zagrażającą życiu, powodującą około 8 milionów zgonów rocznie na całym świecie. Rak przełyku zajmuje szóste miejsce na liście najczęstszych przyczyn zgonów z powodu nowotworów, przyczyniając się do około pół miliona zgonów każdego roku (GLOBOCAN 2012). Wśród różnych podtypów raka przełyku, ESCC jest dominującym typem histologicznym i jest wysoce rozpowszechniony na obszarach słabiej rozwiniętych, zwłaszcza w niektórych regionach Azji i Afryki. Chorym na ESCC oferuje się leczenie multimodalne. Pacjenci we wczesnym stadium zaawansowania z guzami resekcyjnymi są leczeni poprzez resekcję guza, podczas gdy pacjenci w zaawansowanym stadium są najpierw leczeni chemioterapią/chemioradioterapią w celu zmniejszenia stopnia zaawansowania guza przed resekcją chirurgiczną. Mimo, że to przedoperacyjne leczenie neoadjuwantowe pozwala na uzyskanie doskonałej odpowiedzi w podgrupach pacjentów wrażliwych na chemioterapię/chemioradioterapię, około jedna trzecia pacjentów nadal wykazuje tylko częściową i suboptymalną odpowiedź. Nawet w przypadku chorych, u których uzyskano odpowiedź na chemioterapię/chemioradioterapię, u części z nich może rozwinąć się oporność w późniejszym okresie leczenia. Dla tych pacjentów, których guzy są nieresekcyjne i gdy guz jest oporny na chemioterapię lub radioterapię, nie jest dostępne żadne skuteczne leczenie. Aby zapewnić więcej możliwości leczenia pacjentom, którzy nie mogą być poddani obecnym terapiom, proponowane są nowe metody leczenia i oceniane w trwających badaniach klinicznych pod kątem ich skuteczności przeciwnowotworowej. Nawet przy zastosowaniu wszystkich tych ewoluujących i nowo pojawiających się metod leczenia, całkowite wyleczenie choroby jest nadal trudne. W związku z tym, nowe metody leczenia są pilnie potrzebne.

Użycie modeli zwierzęcych ksenograftów guza do badań przedklinicznych

Głównym celem rozwoju modeli zwierzęcych ksenograftów guza do badań jest połączenie badań podstawowych i klinicznych oraz uzupełnienie użycia systemów modelowych in vitro. Modele zwierzęce ksenograftów nowotworowych stanowią bardziej wyrafinowaną platformę do badania procesu nowotworzenia w warunkach in vivo. Platforma ta pozwala nam lepiej zrozumieć udział określonych onkogenów lub supresorów nowotworowych w rozwoju nowotworów poprzez odkrycie powiązanych z nimi szlaków sygnałowych i mechanizmów chorobowych. Poza tym, wykorzystanie tych modeli może dostarczyć nam narzędzia badawczego do przedklinicznej oceny odpowiedzi na lek poprzez określenie skuteczności przeciwnowotworowej, a także toksyczności leku, farmakokinetyki i farmakodynamiki. Oprócz oceny odpowiedzi na lek, modele te mogą również ułatwić badania obrazowania biomedycznego poprzez zapewnienie systemu modelowego do testowania przydatności i praktyczności nowych metod wykrywania guza lub odczynników.

Myszy są najczęściej używanymi zwierzętami do modeli ksenograftów nowotworowych z powodu kilku kluczowych korzystnych cech, takich jak obecność porównywalnej wielkości genomu z ludźmi, krótki cykl reprodukcyjny, duża wielkość miotu, niskie koszty utrzymania i łatwość manipulacji. W badaniach nad nowotworami stosuje się różne szczepy myszy o unikalnym tle niedoboru odporności, w tym atymiczne myszy nagie, myszy SCID i myszy NOD/SCID (myszy SCID z dodatkowym poziomem niedoboru odporności). Spośród tych szczepów myszy NOD/SCID wykazują najlepszy niedobór odporności ze względu na brak lub defekt prawie wszystkich typów komórek odpornościowych (komórek B, komórek T, komórek dendrytycznych, makrofagów i komórek zabójcy naturalnego), następnie myszy SCID pozbawione komórek B i T, a potem atymiczne myszy nagie pozbawione komórek T . Ze względu na różne poziomy niedoboru odporności, różne szczepy są rozważane do wykorzystania w różnych celach badawczych. Biorąc pod uwagę koszt i cechy różnych szczepów, atymiczne nagie myszy i myszy SCID są preferencyjnie używane do wszczepiania ludzkich nowotworowych linii komórkowych, podczas gdy myszy SCID i NOD/SCID są raczej używane do przeszczepiania ludzkich guzów.

Powszechnie stosowane modele zwierzęce ksenograftu guza do badań nad ESCC

Trzy typy modeli zwierzęcych ksenograftu guza do badań nad ESCC są opracowywane przez wszczepianie komórek/ksenograftów ESCC lub guzów pacjenta do zwierząt z niedoborem odporności, mianowicie model podskórny, ortotopowy i model ksenograftu guza pochodzącego od pacjenta (Ryc. 1). Każdy z nich ma swoje mocne i słabe strony pod względem cech modelu (Tabela 1), metod tworzenia (Tabela 2) i przydatności przedklinicznej (Tabela 3), które stawiają je w wyjątkowej pozycji dla badań na wczesnym, średnim lub późnym etapie rozwoju .

.

Model ksenograftu guza podskórnego

Model ksenograftu guza podskórnego jest klasycznym modelem zwierzęcym do badań nad ESCC. Model ten jest tworzony poprzez wszczepianie komórek/ksenograftów ESCC pod skórę zwierząt z niedoborem odporności w celu rozwinięcia guzów podskórnych. Procedura tworzenia guza podskórnego jest technicznie prosta i polega jedynie na wstrzykiwaniu komórek ESCC lub bezpośredniej implantacji ksenograftów ESCC pod skórę zwierząt. Wzrost guzów podskórnych może być wykonywany nieinwazyjnie przy użyciu elektronicznej suwmiarki do pomiaru wyczuwalnych guzów. Te techniczne procedury zakładania i monitorowania guzów mogą utrzymać powtarzalność i efektywność (zarówno czasową jak i kosztową) tego modelu. Pomimo tych zalet, model ten ma pewne ograniczenia, ponieważ nie w pełni reprezentuje sytuację kliniczną. Na przykład, model ten wiąże się z mniejszą heterogennością guza, ponieważ w większości scenariuszy homogenne linie komórkowe ESCC są używane jako materiał źródłowy. Poza tym, guzy podskórne nie rosną w swoim natywnym mikrośrodowisku, co sprawia, że nie nadają się do badania interakcji między guzem a zrębem. Z takimi mocnymi i słabymi stronami, model ten jest głównie używany w badaniach na wczesnym etapie do badania biologii i mechanizmu nowotworzenia ESCC.

Kumulujące się doniesienia ujawniły korzyści płynące z zastosowania modelu ksenograftu guza podskórnego do badań na wczesnym etapie poprzez wykorzystanie go do badania właściwości guzów cząsteczek związanych z ESCC i ich powiązanych mechanizmów chorobowych. Nadekspresja mikroRNA-340, mikroRNA wyciszonego w guzach ESCC, w komórkach EC9706 ESCC hamowała właściwości wzrostu tych komórek w modelu podskórnego ksenografta nowotworowego. Działanie tego mikroRNA na ESCC było pośredniczone częściowo przez jego wpływ na transferazę białkową PSAT1, która została zidentyfikowana w tym samym badaniu jako bezpośredni cel mikroRNA-340. W innym badaniu wykazano szybszy wzrost guzów podskórnych pochodzących z komórek KYSE-30 ESCC z nadekspresją metaloproteinazy macierzy MMP1 w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Ponadto, te komórki ESCC z nadekspresją MMP1 wykazywały również potencjał przerzutowy. Wykazano, że zdolność MMP1 do promowania progresji guza i przerzutów wynika z jej stymulującego wpływu na szlak nowotworowy obejmujący PI3K i AKT. W osobnym raporcie wykorzystano również model ksenograftów z guzami podskórnymi, aby ujawnić komórkowe białko wiążące kwas retinowy 2 (CRABP2) jako supresor nowotworu, wykazując wolniejsze tempo wzrostu guzów podskórnych pochodzących z komórek EC109 ESCC z nadekspresją CRABP2 w porównaniu z kontrolną grupą eksperymentalną. Badania te łącznie wskazują na przydatność tego modelu do badania cząsteczek związanych z ESCC i ich mechanizmów w ESCC.

Oprócz wykorzystania modelu ksenograftów guza podskórnego do badania biologii guza, podjęto próby wykorzystania tego modelu do badania skuteczności przeciwnowotworowej nowych metod leczenia lub związków/leków w leczeniu ESCC. Myszy noszące guzy podskórne były poddawane leczeniu indukującemu ekspresję markera prognostycznego ESCC microRNA-375 i uzyskano mniejszy rozmiar guza na końcu eksperymentu w porównaniu do eksperymentu kontrolnego. Oprócz rutynowego stosowania do badania nowych metod leczenia, model ten został również zastosowany do badania skuteczności przeciwnowotworowej nowych związków/leków przeciwdziałających ESCC, takich jak temsirolimus obecnie stosowany u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym. Poza użytecznością w badaniu antytumorogenności, model ten może być zastosowany do badania efektów chemouczulających badanych związków. Leczenie zwierząt z guzami podskórnymi Ginsenozydem Rg3, składnikiem wyekstrahowanym z żeń-szenia, dostarczyło dowodów wykazujących uwrażliwiające działanie tego związku na dwa leki chemioterapeutyczne paklitaksel i cisplatynę, powszechnie stosowane u pacjentów z ESCC. Ostatnio wykazano, że nowy nośnik tlenu YQ23 wywiera działanie chemiowrażliwe selektywnie na chemiooporne podskórne ksenograty SLMT-1 ESCC, ale nie na chemiowrażliwe ksenograty HKESC-2 ESCC, w planach leczenia z zastosowaniem cisplatyny lub 5-fluorouracylu, które są również tradycyjnymi lekami chemioterapeutycznymi stosowanymi u pacjentów z ESCC. Powyższe badania badające skuteczność przeciwnowotworową badanych związków/leków samodzielnie lub w połączeniu z powszechnymi lekami chemioterapeutycznymi stosowanymi w ESCC podkreśliły przedkliniczną użyteczność podskórnego modelu ksenograftów nowotworowych do testowania związków/leków.

W sumie, podskórne modele ksenograftów nowotworowych, szczególnie te dobrze scharakteryzowane pod względem wrażliwości na chemioterapeutyki obecnie stosowane w ESCC, są cennymi narzędziami badawczymi do badania biologii guza i mechanizmów choroby ESCC w warunkach in vivo oraz do przeprowadzania przedklinicznych badań skuteczności przeciwnowotworowej (Tabela 3).

Orthotopic tumor xenograft model

Orthotopic tumor xenograft model jest alternatywnym zwierzęcym modelem nowotworowym stosowanym w badaniach nad ESCC. Model ten jest tworzony poprzez wszczepianie komórek/ksenograftów ESCC do przełyku zwierząt z niedoborem odporności w celu rozwinięcia guzów ortotopowych. Procedura zakładania guzów ortotopowych jest bardziej wymagająca technicznie w porównaniu do zakładania guzów podskórnych, ponieważ wymaga operacji na małych zwierzętach i/lub znieczulenia. Stosowane są dwie główne metody implantacji komórek/ksenograftów ESCC do przełyku zwierzęcia, które różnią się miejscem implantacji guza. Jedna metoda implantuje komórki/ksenograty ESCC w górnej części przełyku, podczas gdy druga implantuje komórki/ksenograty ESCC w dolnej części przełyku, w okolicy brzusznej, w pobliżu połączenia żołądkowo-przełykowego. Ostatnio donieśliśmy również o porównaniu przeżycia zwierząt z guzem ortotopowym rozwiniętym w górnej części przełyku i w dolnej części i stwierdziliśmy, że te z guzem w okolicy brzusznej mają lepsze przeżycie. Chociaż jest to bardziej czaso- i pracochłonne, aby ustanowić guzy ortotopowe, model ten może pomieścić badanie wzrostu guza w prawidłowym mikrośrodowisku guza, jak w sytuacji klinicznej i umożliwić badanie interakcji guz-stromal . Jednakże, cierpi on również z powodu tego samego ograniczenia co model podskórny, wykorzystując linie komórkowe ESCC jako materiał źródłowy do tworzenia guzów. Inną istotną wadą tego modelu jest konieczność stosowania specjalistycznych metod obrazowania, np. systemu obrazowania in vivo połączonego z wykorzystaniem technologii bioluminescencyjnej, w celu monitorowania wzrostu guza. Pomimo tych ograniczeń, mocne strony tego modelu czynią go wartościowym modelem zwierzęcym do zastosowania w badaniach na średnim i późnym etapie.

Mimo, że ortotopowy model ksenograftów nowotworowych oferuje przewagę nad modelem podskórnym, jego zastosowanie pozostaje ograniczone z powodu wyżej wymienionych ograniczeń. Pomimo tych niedociągnięć, rosnąca liczba doniesień stanowi przykład zastosowania tego modelu do badań nad nowotworami ESCC oraz do przeprowadzania przedklinicznych testów przeciwnowotworowych. Kiedy model ten został wykorzystany do ujawnienia efektu supresyjnego transmembranowej proteazy DESC1, zaobserwowano wolniejsze tempo wzrostu guza przy użyciu komórek KYSE-150 ESCC wykazujących ekspresję DESC1 w porównaniu z komórkami kontrolnymi. W niezależnym badaniu wykorzystującym ten model do badania fenotypu guza związanego z nowotworową kinazą białkową AKT, stwierdzono oczywisty efekt hamujący wzrost guza związany z knockdownem AKT, taki, że zmniejszone tempo wzrostu guzów ortotopowych zostało łatwo wykryte. Oprócz zastosowania do badania wzrostu guza, model ten może być zastosowany do badania mechanizmu inwazji guza. Kompleksowe badania wskazały na udział cząsteczki powierzchni komórkowej CD44H w inwazji guza na podstawie wzorów inwazyjnych zaobserwowanych pomiędzy guzami ortotopowymi pochodzącymi z komórek T.T ESCC i inwazyjnym odpowiednikiem komórek T.T-1 ESCC. Linia komórkowa T.T-1 ESCC wykazuje wysoki poziom ekspresji CD44H i została wyprowadzona z komórek nowotworowych wyizolowanych z węzła chłonnego szyjki macicy w ortotopowym modelu ksenograftów z komórek T.T ESCC. Oprócz zastosowania do badania wzrostu i inwazji guza, model ten umożliwia ocenę wpływu badanych związków na przeżywalność po leczeniu. Wydłużone przeżycie zaobserwowano u zwierząt z ortotopowym guzem ESCC po leczeniu inhibitorem mTOR temsirolimusem, dla którego ten inhibitor jest obecnie stosowany w raku nerkowokomórkowym .

Ogólnie, ortotopowy model ksenograftowy guza uzupełnia regularne stosowanie modelu podskórnego do badania ESCC poprzez zapewnienie prawidłowego mikrośrodowiska guza. Ponadto, model ten funkcjonuje jako niezbędne narzędzie w badaniach przedklinicznych do badania działania przeciwnowotworowego badanych związków/leków (Tabela 3).

Patient-derived tumor xenograft model

Patient-derived tumor xenograft model jest bardziej zaawansowanym zwierzęcym modelem nowotworowym niż wyżej wymienione modele do badań ESCC. Model ten jest tworzony z wykorzystaniem guzów ESCC wyciętych od pacjentów do rozwoju ksenograftów nowotworowych u zwierząt z niedoborem odporności. Guzy pacjentów mogą być wszczepiane podskórnie lub ortotopowo. W zależności od miejsca implantacji guza, model ten zachowuje pewne cechy modelu ksenograftów podskórnych i ortotopowych. Co godne uwagi, ksenografty nowotworowe pochodzące z guzów pacjenta zachowują właściwości genetyczne, histologiczne i fenotypowe guzów dawcy. Ponieważ składniki zrębowe i komórkowe ksenograftów nowotworowych pochodzących od pacjentów są zachowane jak w guzach dawców, zastosowanie tego modelu może wykluczyć wady związane z wykorzystaniem homogennych linii komórek nowotworowych. Pomimo tych zalet, model ten nieuchronnie cierpi na kilka ograniczeń. Stworzenie modelu wymaga użycia wyciętych guzów pacjenta, do których niektóre laboratoria badań podstawowych mogą nie mieć dostępu. Poza tym, wskaźniki engraftmentu guzów pacjenta do tworzenia ksenograftów są suboptymalne i różnią się w zależności od wielu czynników, takich jak typy guzów, miejsca implantacji guzów, szczepy myszy, cechy guza i cechy pacjenta. Nawet w przypadku guza pacjenta, który może być z powodzeniem wszczepiony, wymaga on długiego okresu utajenia, aby urosnąć do ksenograftów nowotworowych i czasami proces ten może trwać nawet 6 miesięcy. Dlatego też, powyższe ograniczenia sprawiły, że proces tworzenia guza jest procedurą kosztowną i pracochłonną. Pomimo tych wad, model ten stopniowo zastępuje inne zwierzęce modele nowotworów, które są wykorzystywane w badaniach na średnim i późnym etapie i jest szczególnie korzystny dla przedklinicznej oceny skuteczności przeciwnowotworowej nowych związków/leków. Rzeczywiście, model ten jest czasami określany jako “badania kliniczne na myszach” ze względu na jego wyższą moc przewidywania odpowiedzi klinicznej badanych związków/leków ze względu na wysokie podobieństwo między ksenograftami nowotworowymi a guzami dawców .

Rozważając wszystkie za i przeciw, model ksenograftów nowotworowych pochodzących od pacjentów może zapewnić nam platformę badawczą nie tylko do badania mechanizmów choroby ESCC, ale może również ułatwić przedkliniczne badania przesiewowe leków. W tym ostatnim przypadku model ten jest bardziej preferowany niż modele podskórne i ortotopowe ze względu na jego wysoką przydatność kliniczną, co przemawia za jego wykorzystaniem do oceny skuteczności przeciwnowotworowej nowych związków/leków. W tym obszarze poszczególne zespoły badawcze stworzyły własne kolekcje modeli ksenograftów nowotworowych pochodzących od pacjentów, z zachowaną heterogennością guza, do badań przesiewowych leków lub kombinacji leków dla ESCC (Tabela 4).

Modele ksenograftów nowotworowych pochodzących od pacjentów z dobrze scharakteryzowanymi deregulacjami molekularnymi powszechnie występującymi w ESCC mogą być wykorzystywane jako narzędzie do testowania obecnie stosowanych leków pod kątem ich nowych zastosowań w ESCC. Proces ten jest o tyle ważny, że pozwala na poszukiwanie nowych leków dla pacjentów opornych na obecnie stosowane terapie. Cisplatyna i 5-fluorouracil to dwa leki chemioterapeutyczne stosowane w ESCC, jednak nie wszyscy pacjenci dobrze reagują na te leki. Aby lepiej zrozumieć mechanizm działania leków, Zhang i wsp. stworzyli panel modeli ksenograftów nowotworowych pochodzących od pacjentów i dobrze scharakteryzowali je pod kątem aberracji genetycznych często wykrywanych w ESCC, takich jak ekspresja HER2 i mutacje EGFR (receptor naskórkowego czynnika wzrostu), K-ras, B-raf i PIK3CA (fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan 3-kinazy, podjednostka katalityczna alfa). Wykorzystując panel ksenograftów z dobrze scharakteryzowanym statusem HER2 i PIK3CA do zbadania efektu leczenia cisplatyną i 5-fluorouracylem, ksenograty nowotworowe negatywne dla HER2 i niosące PIK3CA typu dzikiego były bardziej wrażliwe na takie leczenie w porównaniu z ksenograftami HER2-dodatnimi, niezależnie od statusu mutacji PIK3CA. Wyniki uzyskane w tym badaniu ujawniły związek między składem genetycznym guza a odpowiedzią na leki chemioterapeutyczne.

Oprócz wykorzystania modeli ksenograftów nowotworowych pochodzących od pacjentów o określonym składzie genetycznym do testowania konwencjonalnych leków chemioterapeutycznych, modele te zostały wykorzystane do zbadania skuteczności przeciwnowotworowej leków, które nie są stosowane klinicznie w ESCC, takich jak trastuzumab i lapatynib. Testowanie działania trastuzumabu na ksenograftach guzów pochodzących od pacjentów ujawniło, że HER2-dodatnie ESCC reagowały na takie leczenie, ale nie w przypadku tych z równoczesną mutacją PIK3CA. Dalsze leczenie tych HER2-dodatnich i zmutowanych w PIK3CA ksenograftów guza inhibitorem AKT AZD5363 spowodowało, że ksenograty ponownie reagowały na leczenie trastuzumabem. W innym badaniu badano uwrażliwiający wpływ lapatynibu na leki chemioterapeutyczne – oksaliplatynę lub 5-fluorouracil, stosując model ksenograftów nowotworowych pochodzących od pacjentów. Skojarzone leczenie lapatynibu z 5-fluorouracylem prowadziło do silniejszego efektu hamującego wzrost niż sam lapatynib lub jego skojarzone leczenie z oksaliplatyną. Badania te wyraźnie pokazały przydatność tych modeli do przedklinicznego testowania leków. Co ważne, takie badania na ksenograftach nowotworowych o określonym podłożu genetycznym mogą ułatwić rozwój medycyny precyzyjnej poprzez wybór leczenia farmakologicznego w oparciu o deregulacje genetyczne guzów.

Pacjenckie modele ksenograftów nowotworowych mogą naśladować różnorodność genetyczną i skład ustawień klinicznych ze względu na wysoką zgodność histologiczną i patologiczną między guzami dawców a ustalonymi ksenograftami nowotworowymi. Te wcześniejsze badania wykazały przedkliniczne zastosowanie tych modeli do oceny skuteczności przeciwnowotworowej różnych leków/składników (Tabela 3). Uzyskane wyniki mogą również dostarczyć solidnych dowodów potwierdzających zastosowanie nowych leków/związków w leczeniu ESCC. Takie badania przedkliniczne stanowią zatem istotną platformę przed badaniami klinicznymi.