Quando se trata de colónias de bactérias em crescimento, o LB-agar sobe até à placa – mas primeiro tem de o colocar em estado de gel (uma situação com a qual o seu amigo agarose pode certamente relacionar-se!) “-ose” é um final que normalmente é usado para indicar que algo é um açúcar – e a agarose é um açúcar – mas o ágar também o é! Então qual é a diferença? Eles estão relacionados, mas diferem por mais do que apenas algumas letras e essas diferenças tornam-nos úteis para fazer matrizes de gel para diferentes tarefas – géis de agarose para separar fragmentos de ADN por tamanho e placas de gel de agarose para bactérias em crescimento)

A gar é uma coisa parecida com um peixe e AGAR (aka agar-agar (a sério!)) é uma mistura de 2 açúcares – agaropectina & aquele com que estamos mais familiarizados, a agarose. Então você adquire agarose purificando o ágar-ágar. E para entender porque é que às vezes se passa por esse trabalho, mas não outras vezes, ajuda saber um pouco mais sobre o que são esses açúcares.

Agarose é um polissacarídeo (“poli” significa muitos & açúcar de sacarídeo, portanto um polissacarídeo é uma longa cadeia de subunidades repetidas de açúcar unidas entre si). É um exemplo de um polímero. Os polímeros são cadeias longas de subunidades de repetição. Polímeros diferentes têm subunidades de tipos diferentes (por exemplo, subunidades de nucleotídeos ligam-se para dar-lhe os polímeros que nós chamamos DNA ou RNA; aminoácidos juntam-se para formar proteínas; e açúcares monossacarídeo cadeia -ify para dar carboidratos complexos (como agarose!))

Os açúcares têm muitos grupos de hidroxil (-OH) (que a água gruda alegremente, ajudando-o a formar um gel – um “infinitamente” interligado (como 7° de bacon Kevin) malha de polímero contendo água. (mais para vir)). As unidades individuais de açúcar (monossacarídeos) frequentemente adoptam estruturas anelares (como é o caso da agarose) em que os grupos -OH se destacam como pernas. Os açúcares podem ter o mesmo “linkage”, mas os grupos ligados se destacam de maneiras diferentes & usamos “L” e “D” para nos referirmos a que direção no espaço as pernas apontam. Mais sobre este tipo de estereoquímica aqui: bit.ly/2Q8Dnax

Monosacarídeos podem usar os seus -OH’s para se ligarem entre si. Ligar 2 dá-lhe um dissacarídeo . Adicione mais alguns e você obtém oligossacarídeos (oligo significa poucos). Ligue muitos e você recebe um polissacarídeo (poly significa muitos).

E falando em muitos, os múltiplos -OHs significam que há vários sites de ligação potencial (que nós especificamos por qual número “endereços” nos anéis de açúcar são unidos). Você pode obter “ramificação”, mas em agarose, você tem cadeias lineares (de cerca de 400 subunidades). (Embora os ramos possam ser introduzidos usando “crosslinkers” para fortalecer a agarose para que ela possa fazer coisas como fazer cromatografia de exclusão de tamanho (“filtração em gel”) resina que pode suportar as altas pressões geradas na FPLC (Fast performance liquid chromatography).

Na agarose, a subunidade repetitiva é uma dupla de açúcar (dissacarídeo) de galactose (D-galactose para ser mais preciso) ligada a um monossacarídeo de galactose modificado, 3,6-anidro-L-galactose. Chamamos este duo de AGAROBIOSE (Ligando uma galactose a uma glicose dá-lhe lactose, um dissacarídeo que você pode estar mais familiarizado).

Em galactose, os anéis têm 6 lados com 4 pernas -OH, 5 pernas -H, & 1 perna de metil-hidroxilo (-CH₂OH). Muitas vezes não desenhamos as pernas “-H” porque elas escondem as pernas mais interessantes que são capazes de reagir. Na galactose modificada da agarose, 2 dos grupos -OH ligaram-se & expulsaram um hidrogênio (“anhydro”) para que o braço de metil-hidroxilo seja ligado a um braço -OH formando uma “ponte” sobre o anel.

Sobre 2/3 de agarose é agarose mas, o ágar também contém AGAROPECTINA. É realmente similar (tem D & L galactoses alternadas) MAS muitas dessas galactoses têm modificações. Há várias modificações diferentes incluindo a adição de sulfato(s), ácido pirúvico, ou grupos de metilo, ou o esgueiramento em uma dessas versões de pernas interligadas como a da agarose.

Não parecido com a natureza de repetição consistente de AGAROSE, é apenas a alternância D- & L- “esqueleto” de galactose que é consistente em agaropectina. Suas modificações estão espalhadas por toda a cadeia (por exemplo, ~cada décima está ligada a um sulfato através de uma ligação -O-sulfato, mas isso é apenas em média, e não é provável que eles estejam precisamente, uniformemente, distribuídos). E, enquanto as cadeias tendem a ser mais curtas que as cadeias de agarose, o seu comprimento também é variável, então, a agaropectina é realmente uma mistura e tanto & nunca se sabe bem o que se vai obter!

Porquê usar uma sobre a outra?

DNA tem muitos grupos de fosfatos carregados negativamente (fósforo cercado por 4 oxiógenos). Isto servirá de base para eles se moverem através do gel em direção à extremidade positiva. Então precisamos que o gel seja neutro.

Agar tem um monte de grupos de sulfato (enxofre cercado por oxiógenos). Estes também são carregados negativamente, portanto podem interferir com a forma como o DNA se move através do gel. Assim, ela faria uma má matriz para eletroforese.

MAS a agarose é neutra, fazendo uma boa matriz para eletroforese.

MAS a agarose também é mais cara porque ela tem que ser purificada. Portanto, se você não precisa se preocupar com o problema da carga física, pode muito bem usar algo que tenha uma carga *monetária* mais baixa! Porque o ágar requer menos processamento, é mais barato & perfeito para ser usado como uma matriz para conter bactérias!.

Em placas de ágar, não é o próprio ágar que está fornecendo nutrientes. Essa é uma das grandes coisas do ágar – *a maioria* das bactérias não consegue comê-lo. Em vez disso, o ágar apenas fornece “andaimes” para abrigar os nutrientes que as bactérias precisam. E muitas vezes esses nutrientes são fornecidos através de um “meio de crescimento” bacteriano líquido chamado LB, que, não importa o que os seus manuais possam dizer, (originalmente pelo menos) significa Caldo Lysogeny. Às vezes as iniciais para Luria, Lennox ou Luria & Bertani recebem crédito pelo nome, mas na realidade significa LYSOGENY BROTH e sua receita foi publicada pela primeira vez (por Giuseppe Bertani) em 1951. Ele estava usando-o ao estudar a lisogênese (um processo onde um vírus infectante de bactérias chamado bacteriófago (“fago”) insere o seu próprio DNA no DNA de uma bactéria &, o que deixa o seu tempo até que as condições sejam adequadas para entrar no fago lítico onde ele se corta, faz muitas cópias e explode a célula) http://bit.ly/2HLuB1S

O objectivo do LB é basicamente dar às bactérias o que elas precisam para crescer, dividir e fazer o que queremos (como fazer cópias do DNA que colocamos nelas e/ou fazer cópias de proteínas usando instruções do DNA que colocamos nelas). E fazer isso de forma barata.

Nota: Para a produção de proteínas e de DNA em larga escala, nós cultivamos bactérias em líquido LB reto – “em suspensão” com agitação – mas quando precisamos isolar grupos específicos de bactérias que são todas derivadas da mesma “célula mãe” e, portanto, geneticamente idênticas, nós incorporamos esse LB em um gel para que diferentes “colônias” geneticamente distintas não se misturem, mas ao invés disso cresçam como pontos sombrios. Se você quiser saber mais sobre vários meios de comunicação para as coisas da suspensão confira este post http://bit.ly/bacterialmedia mas hoje vou focar na forma de gel preso.

Não damos a cozinha 5 estrelas às bactérias. Ao invés disso, queremos gastar o mínimo de dinheiro possível enquanto ainda lhes damos os nutrientes que precisam. No mínimo, precisamos dar-lhes uma fonte de energia, algo que eles possam quebrar (catabolizar) para fazer ATP – tais coisas podem ser açúcares, proteínas, gorduras. Além de quebrar as coisas, eles precisam ser capazes de fazer coisas como proteínas e DNA (fazer a parte anabólica do metabolismo). Isto requer nutrientes que fornecem os elementos necessários como carbono e nitrogênio, que felizmente você pode obter com uma receita simples que é suficiente para muitas bactérias.

Existem 3 componentes principais (embora 2 desses componentes em si tenham um monte de componentes.

• TRYPTONE -> é uma mistura de peptídeos formada pela digestão de uma proteína chamada caseína com enzima pancreática -> fornece aminoácidos que as bactérias podem usar para fazer novas proteínas
• YEAST EXTRACT -> este “autolysate” de levedura é basicamente o que quer que tenha acontecido na levedura (compostos orgânicos incluindo vitaminas, oligoelementos, etc.) – e se era suficientemente bom para a levedura…
• Cloreto de sódio (NaCl)(sal de mesa) -> permite o equilíbrio osmótico, transporte, etc.

Uma das principais formulações de LB são as “Miller”, “Lennox”, & versões “Luria” & diferem na quantidade de sal que possuem. Miller & Bertani afoga as bactérias em NaCl (10g/L) enquanto o Lennox usa apenas 5g/L e o Luria apenas 0,5g/L -> receitas tão baixas em sal são boas se você estiver usando um antibiótico sensível ao sal. no papel original, Bertani também adicionou glicose, mas a maioria das receitas posteriores a deixa de fora.

E por falar em deixar as coisas de fora, precisamos de ter a certeza que “deixamos de fora” as bactérias que não queremos, o que podemos fazer “seleccionando para” as bactérias que queremos usando meios de selecção, que contêm coisas como antibióticos, etc., que suprimem o crescimento de coisas que não queremos que cresçam. Por exemplo, quando colocamos genes em bactérias, normalmente o fazemos na forma de pedaços circulares de DNA chamados plasmídeos. Nós desenhamos esses plasmídeos para também ter um gene de resistência a antibióticos, assim podemos aumentar o alimento com esse antibiótico e ele ainda pode crescer, mas outras coisas não podem http://bit.ly/2tcW4ky

Tem também meios diferenciais – isso permite “triagem” ao invés de “seleção” – você não impede que as coisas cresçam, mas muda como elas aparecem – por exemplo, usamos X-gal para triagem azul-branco http://bit.ly/2MxNPs2

Depois de colocar um plasmídeo com meu gene em bactérias e obter colônias, eu escolho algumas dessas colônias e as coloco em LB líquido (com antibiótico) para crescer durante a noite para fazer muitas cópias do plasmídeo, então eu posso purificar essas cópias e enviá-las para sequenciamento para verificar se há erros de digitação antes de entrar na parte de “preparação de expressão”.

Independentemente da mídia que você usa, você precisa que ela seja estéril. Então você o autoclave (coloque-o em uma máquina de lavar louça bem quente e de alta pressão) -> certifique-se de que as garrafas não estejam bem fechadas ou elas explodirão (felizmente eu não cometi esse erro) – e não aperte novamente as tampas até que as garrafas esfriem ou as tampas fiquem presas (eu *fiz* essa). Outro erro a não cometer -> não adicione antibióticos antes da autoclavagem, ou você vai inativá-los. Nós normalmente não adicionamos até logo antes de estarmos prontos para usá-lo.

Na graduação, eu fiz todas as minhas próprias mídias, mas aqui, usamos tanto, temos um técnico de laboratório “media-maker” que é incrível e faz & esterilizar nossas mídias de crescimento bacteriano. Você sabe que algo passou por uma autoclave se as linhas em sua fita autoclave são pretas – a fita é sensível à temperatura, então a cor muda quando fica muito quente. Eu realmente quero projetar uma linha de piadas e/ou trivialidades com a fita autoclave – então se a coisa toda de ensino não der certo, eu acho que tenho um back up!

mais sobre tópicos mencionados (& outros) #365DaysOfScience All (com tópicos listados) 👉 http://bit.ly/2OllAB0

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