Formaldehyde fixatives

Informação sobre 37% Formaldehyde

Não há idade definitiva após a qual 37% de Formaldehyde não é mais útil como solução de estoque. A química do Formaldeído é moderadamente complexa, mas após discussões com outros microscopistas, fabricantes e revisão de textos pertinentes, as seguintes observações são aplicáveis.

• Formaldeído deve ser armazenado à temperatura ambiente (as temperaturas frias favorecem a formação de trioximetileno com um precipitado branco resultante)
• Formaldeído deve ser armazenado hermeticamente selado, já que a exposição ao ar encoraja a oxidação do formaldeído ao ácido fórmico (37% do formaldeído é geralmente enviado com 10-15% de metanol para inibir esta alteração).

A nossa recomendação relativa a 37% de soluções em estoque: Se uma solução de formaldeído a 37% é clara, incolor e sem precipitação, e foi armazenada à temperatura ambiente em um frasco bem fechado que não foi exposto à luz solar, deve ser bom, no entanto, ainda não recomendamos o uso de um frasco de estoque com mais de 1 ano. Garrafas de formaldeído a 37% que já estejam abertas não devem ser usadas por mais de seis meses. Consequentemente, recomendamos que os laboratórios comprem o seu formaldeído com mais frequência e em quantidades menores do que talvez tenham feito no passado.

Não se recomenda a utilização de 37% de formaldeído para fixadores de microscopia electrónica. Ou um formaldeído de grau superior, livre de metanol ou uma solução fresca feita de paraformaldeído é uma escolha muito melhor (veja mais comentários abaixo).

Informação sobre 10% de Formalina

O fixador 10% de formaldeído tamponado é comumente usado para preservar tecidos para histologia de rotina em muitos laboratórios. O formaldeído tem uma maior chance de oxidação nesta concentração de fixador tecidual e eventualmente a solução começará a cair no pH, apesar do tampão. Recomendamos que soluções tampão de formalina 10% sejam utilizadas no máximo 3 meses após terem sido inicialmente misturadas. A solução deve ser clara, incolor, sem precipitação e o pH não deve estar abaixo de 6,5,

O outro problema com a formalina tamponada a 10% é o aumento lento da concentração de metanol (um subproduto indesejado do formaldeído envelhecido). O metanol promove o aglomerado de proteínas, ao invés da ligação cruzada de proteínas que o formaldeído realiza. Um fixador livre de metanol dará a melhor preservação, particularmente se você planeja usar o tecido para coloração de anticorpos posteriormente.

A maneira mais comum de evitar o metanol em uma solução de formaldeído é tornar a solução fresca de paraformaldeído cristalino. O paraformaldeído pode ser bastante perigoso de manusear e muitas vezes é difícil de obter uma solução. Se o seu laboratório não é um utilizador regular de fixadores de formaldeído, existem algumas opções mais fáceis que recomendamos.

Uma opção é comprar formaldeído sem metanol (aq) em ampolas seladas. Basta adicionar PBS para obter a concentração correta de formaldeído e usar imediatamente. Dez ampolas de 10 ml de formaldeído 16% livre de metanol custam aproximadamente $27.

A outra opção é comprar 10% de Formalina neutra tamponada (4% de formaldeído) de uma casa de fornecimento científico, usá-la por 3-6 meses e depois descartá-la (como um material perigoso). Haverá algum metanol nesta solução (tipicamente 1-2%), mas se usado logo após a compra, isto não deve ser significativo para a maioria dos usuários. A solução tamponada ajuda a retardar o processo de acidificação. Uma garrafa de um litro custa aproximadamente 20-25 dólares. Guarde o fixador à temperatura ambiente. Os leitores locais desta página devem contatar o CMM Histology Service Lab (626-4415) se você tiver problemas para localizar um fornecedor. (Por favor note que diferentes fornecedores utilizam diferentes soluções de tamponamento. Para uma imuno-histoquímica e/ou imunofluorescência consistente, os usuários devem ficar com um fornecedor).

Alguns laboratórios perguntaram sobre o uso de formalina a 10% sem tampão. A menos que haja uma razão específica para esta escolha, não a recomendamos, uma vez que este fixador se torna rapidamente ácido. O armazenamento de tecido neste fixador para além de várias horas deve ser fortemente desencorajado.

Recomendações para Fixação Óptima de Espécimes

As amostras de tecido devem ser colocadas no fixador tão rapidamente quanto é razoável após terem sido removidas de um animal, o fixador deve ter pelo menos 20 vezes o volume do tecido e o fixador deve ser mudado após a primeira hora de fixação.

O tecido deve ser cortado de forma a que a dimensão mais fina não seja superior a 4-5mm de espessura (a penetração de formalina é lenta, aproximadamente 0.5mm/hr). Esta é aproximadamente a espessura de dois quartos dos EUA. Se o tecido ou órgão tiver uma cápsula espessa (por exemplo, rim), os usuários devem estar cientes de que a penetração fixadora não será tão rápida através da cápsula. Amostras muito espessas podem acabar fixando em excesso no exterior e mal fixadas no interior, o que causa problemas de interpretação devido aos artefatos corantes.

A fixação inicial deve ser à temperatura ambiente, uma vez que a penetração de formalina está relacionada com a temperatura da solução. A formalina deve ser suavemente agitada antes do uso para evitar um gradiente de concentração no frasco.

O tempo de fixação depende um pouco da espessura do tecido.

• As monocamadas de células cultivadas não precisam ser fixadas por longos períodos, normalmente 15-30 min é adequado. As células cultivadas devem passar da fixação para qualquer protocolo que o laboratório do usuário esteja usando para imuno-histoquímica/imunofluorescência.
• Os tecidos e órgãos devem ser fixados (dependendo do seu tamanho) por 2 horas a um máximo de 24 horas. Posteriormente, os tecidos podem ser armazenados por curtos períodos de tempo (de preferência não mais do que 3 dias) em etanol a 70% (aq). Um armazenamento mais prolongado em qualquer uma das soluções pode fazer com que o tecido se torne excessivamente duro e levar a dificuldades na secção dos blocos de parafina.

O seguimento de um protocolo de fixação padronizado conduzirá aos resultados mais consistentes.

Formalina vs Formaldeído

Ocasionalmente temos encontrado alguma confusão sobre a diferença entre formaldeído e formalina. Este é um problema compreensível, uma vez que os termos são por vezes utilizados de forma intercambiável. É incorrecto usar as duas palavras desta forma. As concentrações de fixador químico que os dois nomes representam são bastante diferentes.

Um fixador rotulado como 10% de formaldeído tamponado é na verdade apenas uma solução de 4% de formaldeído. Isto porque 10% de formalina tamponada é um exemplo do antigo jargão do histologista descrevendo uma solução de 10% feita de uma garrafa de estoque de 37-40% de formaldeído (ou mais precisamente: uma solução de 3,7-4% de formaldeído).

Segurança de Formaldeído

A Administração de Segurança e Saúde Ocupacional dos Estados Unidos (OSHA) está muito preocupada com o formaldeído. Se você não tem uma Ficha de Dados de Segurança de Material (MSDS) atual em seu laboratório para formaldeído você pode localizar uma no SIRI MSDS Archive.

Por favor esteja ciente dos perigos envolvidos com o formaldeído. A seguinte declaração vem de uma MSDS para um Formalin 10% tamponado:

“PERIGO! PODE SER FATAL SE ENGOLIDO. NOCIVO SE INALADO OU ABSORVIDO ATRAVÉS DA PELE. CAUSA IRRITAÇÃO NA PELE, OLHOS E VIAS RESPIRATÓRIAS. FORTE SENSIBILIZANTE. PODE CAUSAR CEGUEIRA. LÍQUIDO COMBUSTÍVEL E VAPOR. SUSPEITA DE RISCO DE CANCRO. CONTÉM FORMALDEÍDO QUE PODE CAUSAR CANCRO. O risco de câncer depende da duração e do nível de exposição”

(para leitores locais) O Departamento de Gerenciamento de Risco da Universidade do Arizona tem um programa de autoestudo chamado “Treinamento de Comunicação de Risco para Formaldeído”. Este guia irá apresentá-lo a todos os aspectos relevantes do padrão de formaldeído da OSHA 1992. De acordo com o Gerenciamento de Riscos “é necessário um treinamento anual para pessoas que utilizam soluções de formaldeído superiores a 0,1% ou materiais capazes de liberar mais de 0,1 ppm de formaldeído”. Isso incluiria a maioria de nós usando formaldeído para histologia ou fixadores de microscopia eletrônica.

Para obter uma cópia do folheto “Treinamento em Comunicação de Perigos para Formaldeído”, entre em contato diretamente com o Departamento de Gerenciamento de Riscos e Segurança (621-1570, Faculdade da Universidade do Arizona, funcionários e estudantes apenas).

▲ topo da página