Microscopia é essencial em muitos aspectos da micologia. Tem 3 usos principais:

1. Detecção de fungos directamente em amostras clínicas – as aparências particulares podem ser altamente características de certas infecções, ou seja, infecção por Zygomycete ou Índia Tinta no líquido cefalorraquidiano. A microscopia directa, se positiva, é mais rápida que a cultura.
2. Confirmação de que a cultura de um fungo transportado pelo ar, como Aspergillus, é a causa da infecção e é pouco provável que seja um contaminante.
3. Identificação de fungos, com base nas aparências morfológicas.

A secção abaixo é bastante técnica e específica e escrita para o trabalhador de laboratório que deseja melhorar as taxas de detecção e capacidade de notificação.

Esta tabela mostra os principais tipos de amostras e achados usados para microscopia directa.

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> Amostra	> Fungi detectável e aparência
CSF	> Yeasts of Cryptococcus	> Preparação de tinta da Índia.
> Raspagem de ar, unhas e pele	Hiphae de dermatófitos ou outros fungos filamentosos Leveduras de Candida	> Fungos diferentes não distinguíveis. Culturas muitas vezes negativas, por isso apenas evidência de infecção por microscopia.
> Muco dos seios paranasais	> Hiphae detectável no muco é diagnóstico de rinossinusite fúngica eosinofílica	> Muco deve ser fixado e corado como para secções histopatológicas. Hyphae pode ser elusiva.
> Dejectos da orelha/rascamento	Hyphae, geralmente com cabeças esporulantes típicas de Aspergillus niger.	Ocasionalmente misturado com Candida e células de levedura.
Raspagem de ceratites por ceratite	Pode ser visto leveduras ou fungos filamentosos	> Ajuda ao sinal precoce de ceratite micotica, não distingue as espécies causadoras
> Supressão ou biópsia do tecido	Hiphae de fungos filamentosos Leveduras de Candida ou outras leveduras. > Fórmulas de C. immitis	> Fungos altamente distintos, incluindo pequenas leveduras sem hifas, sugestivas de C. glabrata, ou hifas não estatais de um Zygomycete.
Fluidos respiratórios	Yeasts sem significado Hyphae (sem leveduras) consistente com a doença Pneumocystis jirovecii	Hyphae geralmente septato e típico de Aspergillus, mas se não for um estado, então considere zigomicose ou mucormicose. Imuunofluorescência superior para P. jirovecii
> Blood film or bone marrow	> Leites intracelulares típicas do Histoplasma ou raramente Penicillium	> Uma característica da histoplasmose disseminada e encontrada em 40%.
Fluido peritoneal	Leveduras ou raramente hifas	> Ajuda na confirmação da Candida peritonite
Gazeadura vaginal	> Candida albicans (levedura e hifa) ou Candida glabrata	Key teste diagnóstico
Mycetoma grain	> Maio mostrar hifas com características	> Usualmente não definitivo em relação às espécies

Metodologia de coloração

A mais antiga preparação específica para microscopia é um concentrado (10-20%) solução de hidróxido de potássio, que amacia a queratina e permite a visualização directa de fungos e alguma avaliação morfológica. As manchas de Gram são menos sensíveis. As colorações de Papanicolau podem ser úteis. As lâminas citológicas podem ser coradas com fita ou com Gomori Methenamine Silver (GMS). A microscopia de imunofluorescência é o melhor método para detectar Pneumocystis. Os branqueadores fluorescentes (Calcofluor branco, Blankophor ou Tinopal UNPA-GX), que se ligam à quitina na parede das células fúngicas, são um meio rápido de scan de amostras de hifas fúngicas, e melhoram a avaliação morfológica.

O papel diagnóstico da microscopia em doenças específicas

CSF e meningite

Células Cryptococcus encapsuladas podem frequentemente ser detectadas em amostras de LCR ou outros fluidos ou secreções do hospedeiro montados na tinta indiana. Cerca de 50% dos pacientes HIV-negativos e mais de 80% dos pacientes HIV-positivos têm um exame de tinta positiva do LCR na Índia. No entanto, linfócitos intactos, em particular, podem ser confundidos com o organismo. Em pessoas com SIDA, as células Cryptococcus são geralmente abundantes no LCR, embora as cápsulas possam ser pequenas, tornando difícil o reconhecimento. Achados persistentemente positivos no LCR em pacientes submetidos a tratamento só devem ser considerados evidência de falha ou recaída se forem confirmados por uma deterioração da condição clínica do paciente ou por culturas positivas.

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Preparação de tinta indiana do LCR mostrando múltiplas leveduras com cápsulas grandes, e botões estreitos para células filhas menores, típicas de C. neoformans

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Micrografia eletrônica de transmissão de uma célula de C. neoformans vista no LCR em um paciente com AIDS com uma cápsula notavelmente pequena presente. Estas células podem ser confundidas com linfócitos.

Filamento de um fungo no LCR de um paciente com meningite que cultivou Candida albicans posteriormente.

Pêlo

Espécimens do couro cabeludo devem incluir raízes de cabelo, o conteúdo de folículos obstruídos e escamas de pele. Excepto no favo, a porção distal do cabelo infectado raramente contém qualquer fungo. Por este motivo, os cabelos cortados sem raízes não são adequados para a investigação micológica. Um método útil para recolher material do couro cabeludo é a escova de cabelo.

O exame microscópico directo do material infectado deve revelar artroconidia da dermatófita localizada no exterior (ectothrix) ou no interior (endothrix) do cabelo afectado. A artroconidia pode ser de tamanho pequeno (2-4 um diâmetro) ou grande (até 10 um diâmetro). As escamas cutâneas conterão hifas e artroconídios. Na infecção por T. schoenleinii (favus), correntes soltas de artroconidia e espaços de ar são vistos dentro dos pêlos afetados. O escutulum (crosta) consiste de micélio, neutrófilos e células epidérmicas.

Raspagem da pele mostrando hifas filamentosas com blankophor.

Pregos

A qualidade da amostra colhida é um fator importante para o sucesso ou não da microscopia e cultura. A colheita de um espécime deve ser indolor, além de um leve desconforto ocasional quando são colhidos espécimes subungueais. A figura abaixo mostra os locais apropriados a partir dos quais as amostras de unhas devem ser obtidas,

As amostras tiradas com um bisturi rombo ou clipes devem ser transportadas em um quadrado dobrado de papel, de preferência preso com um clipe de papel, mas também estão disponíveis embalagens micológicas comerciais. No laboratório, adiciona-se 20-30% de solução de hidróxido de potássio a parte da amostra para macerar a queratina das unhas, para que a amostra possa ser examinada à procura de elementos fúngicos por microscopia directa. Alternativamente, uma parte de cada amostra é examinada em solução dissolvente de unhas contendo um fluorocromo. Um exemplo de uma solução reactiva é este. Ela é preparada dissolvendo 1 g de Na2S em 7,5 ml de água destilada e posteriormente adicionando 2,5 ml de etanol. Posteriormente, 10 ml de Blankophor ou 20 ml de solução aquosa a 1% de Tinopal UNPA-GX (branqueador fluorescente 28, F3543; Sigma) é adicionado a esta mistura.

Mucosa dos seios paranasais

Uma característica diagnóstica da rinossinusite fúngica alérgica (AFRS) é a presença de mucina eosinofílica contendo hifas, recolhida do nariz do doente ou das cavidades dos seios paranasais sem evidência de invasão tecidual por fungos. As hifas podem ser esparsas no conteúdo sinusal e demorar bastante tempo a visualizar com as manchas actualmente utilizadas. Sem esta característica positiva, normalmente são feitos outros diagnósticos, incluindo a rinossinusite alérgica (ARS) ou a rinossinusite eosinofílica da mucina (EMRS). No entanto, a utilização de técnicas de diagnóstico muito mais sensíveis, como a coloração de quitina ou manchas de imunofluorescência anti-Alternaria específicas, pode melhorar a sensibilidade. As características diagnósticas de apoio incluem a presença de cristais de Charcot-Leyden, erosão óssea e opacidade heterogênea com expansão sinusal na tomografia computadorizada.

Canal auditivo e otite externa

Debris e secreções devem ser obtidos do canal auditivo. O exame microscópico direto revelará hifas ramificadas, células de levedura em brotação ou ambas. Em casos de infecção por Aspergillus, as típicas cabeças esportivas podem às vezes ser vistas.

Raspagem corneana para ceratite

Ceratite fúngica é uma emergência médica e precisa ser reconhecida e tratada prontamente. Para o diagnóstico microbiológico, a melhor amostra é o material da parte afetada da córnea; o material pode ser coletado na forma de raspas de uma área ulcerada ou biópsia quando o epitélio corneano está intacto e a infecção confinada ao estroma corneano. As raspas da córnea são obtidas através de um instrumento como uma espátula de platina, lâmina de castor, faca Bard Parker No.15 ou faca de catarata romba. Os cotonetes com pontas de algodão são menos efetivos para o raspado da córnea necrótica. O material deve ser coletado da base e das bordas da parte ulcerada da córnea repetidamente. Se o material tiver sido espalhado sobre um meio estéril, a mesma lâmina ou espátula pode ser usada novamente para coletar material adicional; entretanto, se o material tiver entrado em contato com uma lâmina de microscópio não estéril, a lâmina deve ser trocada enquanto a espátula pode ser flamejada, resfriada e então reutilizada.

O exame microscópico direto de esfregaços corneanos é o meio mais rápido de se fazer um diagnóstico presuntivo. Hifas hialinas de septate de fungos filamentosos vistos podem representar espécies de Aspergillus, Fusarium ou Acremonium. Podem ser observadas hifas sépticas coloridas de feofomicetos, tais como Curvularia. Ocasionalmente Candida spp. é a causa da ceratite e assim podem ser vistas leveduras e hifas, sugerindo este diagnóstico. A microscopia confocal pode ser um meio mais direto de estabelecer o diagnóstico.

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a. Raspagem corneana com algodão lactofenol azul mostra hifas separadas com Fusarium spp ou Aspergillus spp. Dr Philip Thomas, Tiruchirappalli ( a &b )
b. Outra raspagem da córnea com lactofenol de algodão azul mostrando hifas com contas de septo não típicas de Fusarium spp ou Aspergillus spp, ser mais consistente com um fungo dematiceous (isto é, de cor marrom)

Fluídos teciduais e peritoneais
A detecção microscópica de células de levedura típica, pseudo-hifas, e/ou hifas verdadeiras de espécies de Candida em seções teciduais ou fluidos corporais normalmente estéreis é indicativo de candidíase invasiva. Tipicamente, C. glabrata produz apenas células de levedura, e apenas C. albicans produz hifas verdadeiras nos tecidos

Coloração grama de um líquido centrífugo (neste caso urina) contendo C. albicans, mostrando as formas de levedura e hifas, tão frequentemente vistas neste tipo de amostra.

Amostras respiratórias
O exame de esputo é útil em ABPA, uma vez que as hifas podem frequentemente ser vistas com eosinófilos e cristais de Charcot Leyden. Ocasionalmente infecções fúngicas incomuns podem ser diagnosticadas por microscopia quando se visualizam esférulas ou grandes leveduras como a Blastomyces dermatitidis. Aspergillus ou outras hifas filamentosas podem ser vistas em material de lavagem brônquica de traqueobronquite fúngica, por vezes com cabeças esporulantes visíveis. A microscopia tem um rendimento superior ao da cultura na aspergilose pulmonar invasiva a partir de amostras de BAL, em alguns centros, dependendo do método utilizado. Nenhum estudo comparou metodologias para microscopia ou cultura fúngica.

Plugue mucoso examinado por microscopia leve com KOH, mostrando uma rede de hifas ramificadas hialinas típica de Aspergillus, de um paciente com ABPA.

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A mesma preparação de uma amostra de BAL, mostrando hifas hialinas, septo consistente com Aspergillus, corada com Blankophor à esquerda e KOH à direita.

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Preparação de KOH de um líquido respiratório mostrando hifas largas não septadas, típicas de um Zygomycete.

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Blood film or bone marneffei

A sensibilidade da microscopia do sangue e medula óssea não é alta o suficiente para que a maioria das infecções fúngicas justifique o tempo de exame das amostras, com exceção da histoplasmose disseminada e do Penicillium marneffei, geralmente em AIDS.

Mycetoma grain

O diagnóstico de micetoma depende da identificação dos grãos que devem ser obtidos preferencialmente de uma pústula não rompida (seio) com uma agulha estéril. O telhado da lesão deve ser levantado e o conteúdo do seio, incluindo quaisquer grãos, deve ser espremido e colocado sobre uma lâmina de vidro. Cada grão deve ser colhido, lavado em álcool a 70% e depois lavado em solução salina estéril antes de ser cultivado. O exame microscópico direto dos grãos em 20% de hidróxido de potássio confirmará o diagnóstico de micetoma e também revelará se o organismo causal é um fungo ou um actinomicetato. Grãos negros sugerem uma infecção fúngica; grãos brancos minúsculos freqüentemente indicam uma Nocardiainfecção e grãos brancos maiores do tamanho de uma cabeça de alfinete podem ser de origem fúngica ou actinomíactica. Os grãos vermelhos pequenos são específicos da Actinomadura pelletieri, mas os grãos brancos-amarelados podem ser de origem actinomítica ou fúngica. Os grãos actinomíacos contêm filamentos muito finos (<1 um diâmetro), enquanto os grãos fúngicos contêm massas de hifas curtas enredadas (2-4 um diâmetro) que são por vezes pigmentadas.

Denning DW, Evans EGV, Kibbler CC, Richardson MD, Roberts MM, Rogers TR, Warnock DW, Warren RE. Fungal nail disease: a guide to good practice (Relatório de um Grupo de Trabalho da British Society for Medical Mycology). Br Med J 1995; 311: 1277-1281.

Monod M, Baudraz-Rosselet F, Ramelet AA, Frenk E. Exame micológico direto em dermatologia: uma comparação de diferentes métodos. Dermatologica. 1989;179(4):183-6. PMID: 2695355

Procop GW, Haddad S, Quinn J, Wilson ML, Henshaw NG, Reller LB, Artymyshyn RL, Katanik MT, Weinstein MP. Detecção de Pneumocystis jiroveci em amostras respiratórias através de quatro métodos de coloração. J Clin Microbiol. 2004 Jul;42(7):3333-5. PubMed PMID: 15243109; PubMed Central PMCID: PMC446244.