Când vine vorba de cultivarea coloniilor de bacterii, LB-agarul face un pas înainte – dar mai întâi trebuie să-l aduci în stare de gel (o situație la care prietenul său agaroza se poate referi cu siguranță!) “-ose” este o terminație care se folosește de obicei pentru a indica faptul că ceva este un zahăr – iar agaroza este un zahăr – dar la fel este și agaroza! Deci, care este diferența? Sunt înrudite, dar diferă prin mai mult de câteva litere, iar aceste diferențe le fac utile pentru a face matrici de gel pentru diferite sarcini – geluri de agaroză pentru separarea fragmentelor de ADN în funcție de dimensiune și plăci de gel de agar pentru cultivarea bacteriilor)
Un gar este un lucru asemănător cu un pește, iar AGAR (aka agar-agar (serios!)) este un amestec de 2 zaharuri – agaropectina & cel cu care suntem mai familiarizați, agaroza. Așa că se obține agaroza prin purificarea agarului. Și pentru a înțelege de ce te chinui uneori, dar alteori nu, este util să știi puțin mai multe despre ce sunt aceste zaharuri.
Agaroza este o polizaharidă (“poli” înseamnă mai multe & zaharuri & de zaharuri, deci o polizaharidă este un lanț lung de subunități repetate de zahăr unite între ele). Este un exemplu de polimer. Polimerii sunt lanțuri lungi de subunități care se repetă. Diferiți polimeri au subunități de diferite tipuri (de exemplu, subunitățile de nucleotide se leagă între ele pentru a da polimerii pe care îi numim ADN sau ARN; aminoacizii se unesc pentru a forma proteine; iar zaharurile monosacaridice se înlănțuie pentru a da carbohidrați complecși (precum agaroza!))
Azahărul are o mulțime de grupe hidroxil (-OH) (de care apa se lipește cu plăcere, ajutându-vă să formați un gel – o plasă de polimeri interconectată “la infinit” (ca 7° de Kevin bacon) care conține apă. (mai multe în continuare)). Unitățile individuale de zahăr (monozaharide) adoptă adesea structuri inelare (cum este cazul agarozei) în care grupurile -OH ies în afară ca niște picioare. Zaharurile pot avea aceeași “legătură”, dar au grupările legate care ies în afară în moduri diferite & folosim “L” și “D” pentru a ne referi la direcția din spațiu în care arată picioarele. Mai multe despre o astfel de stereochimie aici: bit.ly/2Q8Dnax
Monosacaridele pot folosi -OH-urile lor pentru a se lega între ele. Prin legarea a 2 se obține o dizaharidă . Adăugați încă câteva și veți obține oligozaharide (oligo înseamnă puține). Dacă legați mai multe și veți obține o polizaharidă (poli însemnând multe).
Și apropo de multe, multiplele -OH-uri înseamnă că există mai multe situsuri potențiale de legătură (pe care le specificăm prin numărul de “adrese” de pe inelele de zahăr care sunt unite). Puteți obține “ramificări”, dar în agaroză aveți lanțuri liniare (de aproximativ 400 de subunități). (Deși ramificațiile pot fi introduse folosind “reticulanți” pentru a întări agaroza astfel încât să poată face lucruri precum fabricarea rășinii pentru cromatografia de excludere a dimensiunii (“filtrare pe gel”) care poate rezista la presiunile ridicate generate în FPLC (cromatografia lichidă cu performanțe rapide).
În agaroză, subunitatea repetitivă este un duo de zahăr (dizaharidă) de galactoză (mai exact D-galactoză) legat de o monosacaridă de galactoză modificată, 3,6-anhidro-L-galactoză. Numim acest duo AGAROBIOSE (Legând o galactoză de o glucoză se obține lactoza, o dizaharidă cu care poate sunteți mai familiarizați).
În galactoză, inelele au 6 laturi cu 4 ramuri -OH, 5 ramuri -H, & 1 ramură metilhidroxil (-CH₂OH). Adesea nu desenăm picioarele “-H” deoarece acestea ascund picioarele mai interesante care sunt capabile să reacționeze. În galactoza modificată de agaroză, 2 dintre grupele -OH s-au legat & au dat afară un hidrogen (“anhydro”) astfel încât brațul metil-hidroxil este legat de un braț -OH formând o “punte” peste inel.
Circa 2/3 din agaroză este agaroză dar, agaroza conține și AGAROPECTINĂ. Este foarte asemănătoare (are galactoze D & L alternante), DAR multe dintre aceste galactoze au modificări. Există mai multe modificări diferite, inclusiv adăugarea de sulfat(uri), acid piruvic sau grupări metil, sau introducerea pe furiș a uneia dintre acele versiuni cu picioare legate, cum este în agaroză.
În comparație cu natura repetitivă consistentă a AGAROZEI, doar “scheletul” alternativ de D- & L- galactoză este consistent în agaropectină. Modificările sale sunt împrăștiate de-a lungul lanțului (de exemplu, ~fiecare 10 este atașat la un sulfat printr-o legătură -O-sulfat, dar asta doar în medie, și nu este probabil ca acestea să fie distribuite precis, uniform). Și, în timp ce lanțurile tind să fie mai scurte decât lanțurile de agaroză, lungimea lor este, de asemenea, variabilă, așa că, agaropectina este într-adevăr un amestec & niciodată nu știi exact ce vei obține!
De ce să folosești una în locul celeilalte?
ADN-ul are o mulțime de grupări fosfat cu sarcină negativă (fosfor înconjurat de 4 oxigeni). Aceasta va servi ca bază pentru ca ele să se deplaseze prin gel spre capătul pozitiv. Deci avem nevoie ca gelul să fie neutru.
Agarul are o mulțime de grupe sulfat (sulf înconjurat de oxi-geni). Acestea sunt, de asemenea, încărcate negativ, deci pot interfera cu modul în care ADN-ul se mișcă prin gel. Deci ar fi o matrice proastă pentru electroforeză.
Dar agaroza este neutră, fiind o matrice bună pentru electroforeză.
Dar agaroza este, de asemenea, mai scumpă, deoarece trebuie purificată. Deci, dacă nu trebuie să vă faceți griji cu privire la problema încărcăturii fizice, ați putea la fel de bine să folosiți ceva care are o încărcătură *monetară* mai mică! Deoarece agarul necesită mai puțină procesare, este mai ieftin & perfect pentru a fi folosit ca matrice pentru a ține hrana bacteriilor!!!
În plăcile de agar, nu agarul în sine este cel care furnizează nutrienți. Acesta este unul dintre lucrurile grozave despre agar – *majoritatea* bacteriilor nu-l pot mânca. În schimb, agarul oferă doar “scheletul” pentru a găzdui nutrienții de care au nevoie bacteriile. Și, adesea, acești nutrienți sunt furnizați printr-un “mediu de creștere” de hrană bacteriană lichidă numit LB, care, indiferent de ceea ce ar putea spune manualele dumneavoastră, (cel puțin la origine) înseamnă Lysogeny Broth. Uneori, inițialele pentru Luria, Lennox sau Luria & Bertani primesc credit pentru acest nume, dar în realitate înseamnă LYSOGENY BROTH, iar rețeta sa a fost publicată pentru prima dată (de Giuseppe Bertani) în 1951. El o folosea atunci când studia lizogenia (un proces prin care un virus care infectează bacteriile, numit bacteriofag (“fag”), își inserează propriul ADN în ADN-ul unei bacterii & își așteaptă timpul până când condițiile sunt potrivite pentru a intra în fagul litic, unde se taie singur, face o mulțime de copii și sparge celula) http://bit.ly/2HLuB1S
Scopul LB este, în esență, de a da bacteriilor ceea ce au nevoie pentru a crește, a se diviza și a face ceea ce vrem noi (cum ar fi să facă copii ale ADN-ului pe care îl introducem în ele și/sau să facă copii ale proteinelor folosind instrucțiuni din ADN-ul pe care îl introducem în ele). Și pentru a face acest lucru în mod ieftin.
Nota: Pentru producerea de proteine și producerea de ADN la scară largă, cultivăm bacteriile în lichid LB pur și simplu – “în suspensie” cu agitare – dar atunci când avem nevoie să izolăm grupuri specifice de bacterii care sunt toate derivate din aceeași “celulă mamă” și, prin urmare, identice din punct de vedere genetic, încorporăm acel LB într-un gel, astfel încât diferitele “colonii” distincte din punct de vedere genetic să nu se amestece, ci să crească sub formă de puncte lipicioase. Dacă vreți să aflați mai multe despre diverse medii pentru chestiile de suspensie, consultați această postare http://bit.ly/bacterialmedia, dar astăzi mă voi concentra asupra formei prinse în gel.
Nu le oferim bacteriilor o bucătărie de 5 stele. În schimb, vrem să cheltuim cât mai puțini bani posibil, oferindu-le în același timp nutrienții de care au nevoie. Cel puțin, trebuie să le oferim o sursă de energie, ceva ce pot descompune (cataboliza) pentru a produce ATP – astfel de lucruri pot fi zaharuri, proteine, grăsimi. În plus față de descompunerea lucrurilor, ei trebuie să fie capabili să producă lucruri precum proteine și ADN (să facă partea anabolică a metabolismului). Acest lucru necesită nutrienți care să furnizeze elementele necesare, cum ar fi carbonul și azotul, pe care, din fericire, le puteți obține cu o rețetă simplă care este suficientă pentru o mulțime de bacterii.
Există 3 componente principale (deși 2 dintre aceste componente au ele însele o mulțime de componente.
- TRYPTONĂ -> acesta este un amestec de peptide format prin digerarea unei proteine numite cazeină cu enzima pancreatică -> aceasta furnizează aminoacizi pe care bacteriile îi pot folosi pentru a produce noi proteine
- EXTRACT DE LEVURĂ -> acest “autolizat” de drojdie este practic doar ceea ce s-a întâmplat să fie în drojdie (compuși organici, inclusiv vitamine, oligoelemente, etc.) – și dacă a fost suficient de bun pentru drojdie…
- CHLORURA DE SODIU (NaCl)(sare de masă) -> permite echilibrul osmotic, transportul etc.
Câteva dintre principalele formulări LB sunt versiunile “Miller”, “Lennox”, & “Luria” & acestea diferă prin cantitatea de sare pe care o au. Miller & Bertani îneacă bacteriile în NaCl (10g/L), în timp ce Lennox folosește doar 5g/L, iar Luria doar 0,5g/L -> astfel de rețete sărace în sare sunt bune dacă folosiți un antibiotic sensibil la sare. în lucrarea originală, Bertani a adăugat și glucoză, dar majoritatea rețetelor ulterioare o lasă deoparte.
Și apropo de omiterea unor lucruri, trebuie să ne asigurăm că “omitem” bacteriile pe care nu le dorim, ceea ce putem face prin “selectarea” bacteriilor pe care le dorim folosind medii de selecție, care conțin lucruri precum antibiotice etc. care suprimă creșterea lucrurilor pe care nu doriți să le creșteți. De exemplu, atunci când introducem gene în bacterii, o facem în mod normal sub forma unor bucăți circulare de ADN numite plasmide. Proiectăm aceste plasmide pentru a avea și o genă de rezistență la antibiotice, astfel încât să putem să înțepăm alimentele cu acel antibiotic și ele pot crește în continuare, dar alte lucruri nu pot http://bit.ly/2tcW4ky
Există, de asemenea, medii diferențiale – acest lucru permite “screening-ul”, spre deosebire de “selecție” – nu împiedicați lucrurile să crească, dar schimbați modul în care acestea apar – de exemplu, noi folosim X-gal pentru screening-ul alb-albastru http://bit.ly/2MxNPs2
După ce am pus o plasmidă cu gena mea în bacterii și obțin colonii, aleg câteva dintre aceste colonii și le pun în LB lichid (cu antibiotic) pentru a crește peste noapte pentru a face o mulțime de copii ale plasmidului, apoi pot purifica aceste copii și le pot trimite pentru secvențiere pentru a verifica dacă există greșeli de scriere înainte de a intra în partea de “pregătire a expresiei”.
Indiferent de mediul pe care îl folosiți, trebuie să fie steril. Așa că îl autoclavezi (îl bagi într-o mașină de spălat vase foarte fierbinte, la presiune înaltă) -> asigură-te că sticlele nu sunt închise ermetic sau vor exploda (din fericire nu am făcut această greșeală) – și nu strângi din nou capacele până când sticlele nu s-au răcit sau capacele se vor bloca (am *făcut* asta). O altă greșeală pe care să nu o faceți -> nu adăugați antibiotice înainte de autoclavare, altfel le veți inactiva. De obicei, noi nu le adăugăm decât chiar înainte de a le folosi.
În facultate, îmi făceam singur toate mediile, dar aici, folosim atât de mult, încât avem un tehnician de laborator “media-maker” care este uimitor și face & sterilizează mediile noastre de creștere bacteriană. Știi că ceva a trecut printr-un autoclav dacă liniile de pe banda autoclavului sunt negre – banda este sensibilă la temperatură, așa că își schimbă culoarea atunci când se încălzește foarte tare. Chiar vreau să proiectez o linie de bandă autoclavă cu mesaje de glume și/sau trivia – așa că, dacă toată treaba cu predatul nu merge, cred că am o soluție de rezervă!
mai multe despre subiectele menționate (& altele) #365DaysOfScience All (cu subiectele enumerate) 👉 http://bit.ly/2OllAB0
.
