1.4.3.2 Myggor
Myggor är smittbärare av allvarliga sjukdomar hos människor som malaria, denguefeber och gula febern, och trots ansträngningar för att kontrollera dem är de fortfarande ett allvarligt problem. Identifiering av nya gener för myggor som är involverade i lukt, blodsätning, matsmältning, reproduktion, immunitet etc. förväntas ge underlag för utveckling av nya metoder för att kontrollera myggpopulationer och myggburna sjukdomar (Chen et al.,
Den senaste informationen om genomsekvenserna för tre stora myggvektorer, Anopheles gambiae, Aedes aegypti och Culex pipiens quinquefasciatus (http://www.vectorbase.org/), har använts för komparativ genomik och studier av transkriptionsprofiler som gör det möjligt att identifiera stora grupper av nya mygggener. RNAi har snabbt blivit det bästa verktyget för att karakterisera genernas funktion inom olika områden av myggbiologi och interaktioner mellan myggor och patogener (t.ex. Fragkoudis et al., 2009). Detta har resulterat i publicering av ganska många funktionella RNAi-analyser i denna organismgrupp, inklusive medlemmar av aedinerna (A. aegypti, Armigeres subalbtus och C. pipiens) och anophelinerna (A. gambiae och Anopheles stephensi). De flesta av dessa studier har dock inriktats på endast två arter: A. aegypti, som är den huvudsakliga smittbäraren av denguefeber och gula febern, och A. gambiae, som är den afrikanska smittbäraren av malaria (tabell 1.1).
I dessa studier har den typiska experimentella strategin inneburit mikroinjektion av dsRNA i thorax hos vuxna myggor följt av utfodring, utmaning med patogener, luktämnen, insekticider eller stressande förhållanden och efterföljande undersökning av myggorna för att analysera den fenotypiska effekten av tystandet av den målinriktade genen på den fysiologiska process som undersöks, inklusive lukt, utfodring, matsmältning och ämnesomsättning, stress, avgiftning, kutikuledbildning, reproduktion, immunitet och diapauseregulering. I det följande presenterar vi några representativa studier av RNAi hos myggor.
Olfaction medierar ett stort antal beteenden hos både vuxna och larviga myggor, inklusive födointag, värdpreferens, lokalisering/val av partner och avelsplatser för äggläggning. Olfaction innebär att man uppfattar kemiska stimuli som tillhandahålls av luktmolekyler och utvecklar specifika reaktioner på sådana stimuli. Luktämnen fångas upp av luktbindande proteiner (OBP) som transporterar dem till luktreceptorerna (OR) på luktneuronernas dendritiska membran. Nyligen har RNAi-målsättning av både OBP- och OR-gener gett värdefull information om deras funktion i luktmekanismen och deras specificitet (Biessmann et al., 2010; Liu et al., 2010; Pelletier et al, 2010), vilket öppnar möjligheten att modifiera luktuppfattningen och därmed en rad beteenden som skulle kunna leda till att myggbett och parning förhindras.
I tempererade klimat övervintrar vuxna honmyggor i diapause, en period av dvala som kännetecknas av avsaknad av värdsökande beteende, ackumulering av enorma fettreserver och ett stopp i utvecklingen av äggstockarna. Om man manipulerar regleringen av denna period av dvala skulle man till exempel kunna framkalla vilande, icke värdsökande myggor. Detta har exemplifierats i flera studier från dr Denlingers grupp. De har särskilt nyligen använt RNAi för att undersöka diapausemekanismen hos C. pipiens, för att bevisa att insulin/FOXO-signalvägen deltar i regleringen av diapausen (Sim och Denlinger, 2008, 2009a). De har också bevisat att vissa fettsyrasyntaser är inblandade i ackumuleringen av fettreserver hos övervintrande honor (Sim och Denlinger, 2009b) och att ribosomala proteiner S3 och S2 spelar en roll i follikelutvecklingen hos honor som inte diapauserar (Kim och Denlinger, 2010; Kim et al., 2010).
Vitellogenes och reproduktion har också karakteriserats med RNAi hos myggor. I likhet med situationen hos fästingar kräver anautogena myggor intag av ryggradslöst värdblod för att inleda en reproduktionscykel med äggproduktion. De aminosyror (AA) som härrör från blodmjölet används av myggans fettkropp för att syntetisera äggulaproteinprekursorer, främst vitellogenin (Vg), i en process som kallas vitellogenes. Vg frigörs sedan i hemolymfen och tas upp av äggstockarna och deponeras i äggceller under utveckling genom en specifik VgR.
I myggan A. aegypti har Vg-genuttrycket studerats intensivt av Dr. Raikhels grupp i en lång rad eleganta experiment, där de använde RNAi som verktyg för omvänd funktionell genomik. Teamet visade att transkriptionen av Vg-genen regleras noggrant av de kombinerade insatserna från flera molekyler, inklusive steroidhormonet 20-hydroxyecdyson (20E)-kaskaden och näringsämnet AA/Target-of-Rapamycin (TOR)-signalering. Detta serin/treoninkinas är ansvarigt för att överföra AA-signalen och aktivera fosforylering av S6-kinas som krävs för aktivering av translationella händelser (Park et al., 2006; Roy och Raikhel, 2011). Vidare har samma grupp genom att injicera en specifik antagomir åstadkommit RNAi-medierad utarmning av miRNAi miR-27 för att påvisa miR-27:s funktion som positiv regulator i både blodsmältning och äggutveckling. Faktum är att miR-27 i sig regleras av 20E- och AA/TOR-vägarna (Bryant et al., 2010).
Det medfödda immunsystemet hos myggvektorer omfattar tre funktionella kategorier av gener som är involverade i patogenigenkänning, signalvägar som medierar signalförstärkning, modulering och transduktion samt effektormekanismer som medierar patogenens rensning från värden (Baton et al., 2008). RNAi är i sig själv en viktig antiviral immunmekanism hos myggor. Vid RNA-baserad antiviral immunitet känns viralt dsRNA igen och bearbetas till siRNA av myggan Dicer. Därefter styr dessa virusavledda siRNAs specifik antiviral immunitet genom RNAi och relaterade RNA silencing-effektormekanismer (Ding, 2010). Ett flertal artiklar rapporterar om användningen av RNAi för att karakterisera funktionen hos myggans immungener. Studier av allmänna immunmekanismer och effektorer har fokuserat på receptorer för mönsterigenkänning, antibakteriella och svampbekämpande signalvägsmolekyler och proteiner som är involverade i andra cellulära effektormekanismer (granskad i Dong et al., 2006; Moita et al., 2005; Shin et al., 2003, 2006; Wang et al., 2006).
RNAi har också använts för att karakterisera gränssnittet mellan mygga och patogen, och i många undersökningar har man tittat på immurrelaterade myggmolekyler. Molekylära interaktioner vid gränssnittet mellan mygga och patogen säkerställer överlevnad och utveckling för både patogenen och vektorn. Att förstå de molekylära interaktionerna mellan patogener och deras myggvektorer är därför grundläggande för utvecklingen av nya kontrollåtgärder. Under det senaste decenniet har intensiva forskningsinsatser gjorts för att identifiera och funktionellt karakterisera de mygggener som är involverade i patogeninducerade immunsvar med hjälp av en rad olika metoder, bland annat komparativ genomik, transkriptionsprofilering och RNAi-baserad funktionell analys (Baton et al., 2008). Dessa ansträngningar har främst varit inriktade på två mygg- och patogenassociationer, A. gambiae-Plasmodium sp. och A. aegypti-denguevirus 2 (DENV-2). Myggornas medfödda immunförsvar mot arbovirusinfektion har granskats i detalj av Fragkoudis et al. (2009), och de mot malariaparasiter har nyligen granskats av Brown och Catteruccia (2006) och Baton et al. (2008), inklusive RNAi-strategier.
De flesta av dessa RNAi-baserade studier har riktat in sig på gener från myggans immunförsvarsmekanismer snarare än på gener som patogenerna behöver för att utvecklas i myggans vektor. När det gäller de antimalariagener från myggor som utsatts för RNAi knock-down är de flesta av dem involverade i ookinete-dödning och melanisering under penetrering av mellangärdet (granskad i Brown och Catteruccia, 2006; Baton et al., 2008). När det gäller de antivirala mygggener som utsätts för knock-down är vissa komponenter i signalvägar, medan andra utgör en del av det RNAi-baserade antivirala försvaret (granskad i Fragkoudis et al., 2009).
En av de senaste artiklarna presenterar Guo et al. (2010) ett användbart tillvägagångssätt för att identifiera nya A. aegypti-proteiner som interagerar med DENV-2. Dessa författare utvecklade det första utkastet till myggproteininteraktionsnätverket med hjälp av en beräkningsmetod och identifierade 714 förmodade DENV-associerade A. aegypti-proteiner som grupperas i fyra funktionella huvudkategorier (replikation/transkription/translation, immunitet, transport och metabolism). Tio av dessa förmodade DENV-associerade proteiner valdes slumpmässigt ut för validering genom RNAi-medierad genavstängning, och denguevirustitern i myggans mellangärden minskade signifikant för fem av dem.
Dessa resultat stöder sammantaget uppfattningen att RNAi skulle kunna vara ett kraftfullt verktyg för höggenomgångskaraktärisering av immunsystemet hos insektssjukdomsvektorer och därmed bidra till identifiering och karakterisering av potentiella myggmål för utveckling av nya metoder för att kontrollera myggpopulationer, parasiter inuti myggor och myggburna sjukdomar.
Efter upptäckten att RNAi är ett av myggans viktigaste försvar mot arbovirus har det rapporterats att undertryckande av denna väg ökar virusbelastningen i infekterade myggor (Sanchez-Vargas et al, 2009). Cirimotich et al. (2009) använde ett Sindbis-virus som konstruerats för att uttrycka ett protein som binder till dsRNA och förmodligen skyddar det från bearbetning i RNAi-vägen och därmed fungerar som en RNAi-undertryckare. Detta konstruerade virus producerar mycket fler viruspartiklar än normalt i infekterade myggor och är dödligt för en rad olika myggarter (A. aegypti, Aedes albopictus, C. trithaeniorhynchus). Detta tillvägagångssätt är ett exempel på ny genetikbaserad utveckling, potentiellt användbar i “populationsundertryckningsstrategier” för myggbekämpning (Alphey, 2009).
Det motsatta målet, det vill säga artificiell förstärkning av RNAi-baserad antiviral myggimmunitet för att erhålla virusresistenta myggor, har också utvecklats. Antiviral RNAi har använts för att ge resistens mot DENV i transgena A. aegypti-myggor, genom att uttrycka ett hårnåls-RNA som motsvarar ett fragment av viruset (Franz et al., 2009). Med hjälp av vävnads- och tidsspecifika promotorer kan uttrycket av hårnåls-RNA begränsas till mellangärdet – de första cellerna som infekteras – och endast efter blodmåltid, vilket minimerar potentiella problem för myggans kondition som härrör från det konstitutiva uttrycket av ett RNA med långa hårnålar. En diskussion om fördelarna och problemen med att använda denna typ av transgena resistenta myggstammar i “populationsersättningsstrategier” för myggbekämpning finns i Alphey (2009)
.