Cuando se trata de cultivar colonias bacterianas, el LB-agar da un paso adelante en la placa – pero primero hay que ponerlo en estado de gel (¡una situación con la que su amiga la agarosa seguramente puede relacionarse!) La “-osa” es una terminación que suele utilizarse para indicar que algo es un azúcar, y la agarosa es un azúcar, pero también lo es el agar. ¿Cuál es la diferencia? Están relacionados, pero se diferencian por algo más que unas pocas letras y esas diferencias los hacen útiles para hacer matrices de gel para diferentes tareas – geles de agarosa para separar fragmentos de ADN por tamaño y placas de gel de agar para cultivar bacterias)
Un gar es una cosa parecida a un pez y el AGAR (también conocido como agar-agar (¡en serio!)) es una mezcla de 2 azúcares – agaropectina & el que nos es más familiar, la agarosa. Así que se obtiene agarosa purificando el agar. Y para entender por qué a veces se pasa por ese problema, pero otras veces no, ayuda a saber un poco más sobre lo que son estos azúcares.
La agarosa es un polisacárido (“poli” significa el azúcar de muchos &sacáridos, por lo que un polisacárido es una larga cadena de subunidades de azúcares repetidos unidos). Es un ejemplo de polímero. Los polímeros son largas cadenas de subunidades que se repiten. Los diferentes polímeros tienen subunidades de diferentes tipos (por ejemplo, las subunidades de nucleótidos se unen para dar lugar a los polímeros que llamamos ADN o ARN; los aminoácidos se unen para formar proteínas; y los azúcares monosacáridos se unen en cadena para dar lugar a carbohidratos complejos (¡como la agarosa!))
Los azúcares tienen muchos grupos hidroxilos (-OH) (a los que el agua se adhiere alegremente, ayudándole a formar un gel – una malla polimérica interconectada “infinitamente” (como 7° de Kevin bacon) que contiene agua. (más por venir)). Las unidades individuales de azúcar (monosacáridos) a menudo adoptan estructuras de anillo (como es el caso de la agarosa) en las que los grupos -OH sobresalen como patas. Los azúcares pueden tener el mismo “enlace” pero tener los grupos enlazados sobresaliendo de diferentes maneras & utilizamos “L” y “D” para referirnos a qué dirección en el espacio apuntan las patas. Más sobre esta estereoquímica aquí: bit.ly/2Q8Dnax
Los monosacáridos pueden utilizar sus -OH para enlazarse. Uniendo 2 se obtiene un disacárido . Si se añaden algunos más, se obtienen oligosacáridos (oligo significa pocos). Enlaza muchos y obtienes un polisacárido (poli significa muchos).
Y hablando de muchos, los múltiples -OHs significan que hay múltiples sitios potenciales de enlace (que especificamos por el número de “direcciones” en los anillos de azúcar que se unen). Se pueden conseguir “ramificaciones”, pero en la agarosa se tienen cadenas lineales (de unas 400 subunidades). (Aunque las ramificaciones pueden introducirse utilizando “reticuladores” para fortalecer la agarosa, de modo que pueda hacer cosas como fabricar resina de cromatografía de exclusión por tamaño (“filtración en gel”) que pueda soportar las altas presiones generadas en la FPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento).
En la agarosa, la subunidad que se repite es un dúo de azúcares (disacárido) de galactosa (D-galactosa para ser precisos) unido a un monosacárido de galactosa modificado, 3,6-anhidro-L-galactosa. Llamamos a este dúo AGAROBIOSA (La unión de una galactosa a una glucosa da lugar a la lactosa, un disacárido con el que quizás esté más familiarizado).
En la galactosa, los anillos tienen 6 lados con 4 patas de -OH, 5 patas de -H, & 1 pata de metilhidroxilo (-CH₂OH). A menudo no dibujamos las patas “-H” porque ocultan las patas más interesantes que son capaces de reaccionar. En la galactosa modificada de la agarosa, 2 de los grupos -OH se han enlazado & expulsado un hidrógeno (“anhidro”) de modo que el brazo hidroxilo del metilo se une a un brazo -OH formando un “puente” sobre el anillo.
Alrededor de 2/3 del agar es agarosa pero, el agar también contiene AGAROPECTINA. Es realmente similar (tiene galactosas D & L alternadas) PERO muchas de esas galactosas tienen modificaciones. Hay varias modificaciones diferentes, incluyendo la adición de sulfato(s), ácido pirúvico, o grupos de metilo, o colar en una de esas versiones de patas enlazadas como en la agarosa.
A diferencia de la naturaleza de repetición consistente de AGAROSE, es sólo la alternancia de D- & L- galactosa “esqueleto” que es consistente en agaropectin. Sus modificaciones están dispersas a lo largo de la cadena (por ejemplo, ~cada 10º está unido a un sulfato a través de un enlace -O-sulfato, pero eso es sólo en promedio, y no es probable que estén distribuidos de manera precisa y uniforme). Y, mientras las cadenas tienden a ser más cortas que las cadenas de agarosa, su longitud es también variable, así que, la agaropectina es realmente una mezcla & ¡nunca se sabe exactamente lo que se va a obtener!
¿Por qué usar uno sobre el otro?
El ADN tiene muchos grupos fosfato cargados negativamente (fósforo rodeado de 4 oxígenos). Esto servirá de base para que se muevan a través del gel hacia el extremo positivo. Así que necesitamos que el gel sea neutro.
El agar tiene muchos grupos sulfato (azufre rodeado de oxígenos). Estos también están cargados negativamente, por lo que pueden interferir con el movimiento del ADN a través del gel. Así que sería una mala matriz para la electroforesis.
PERO la agarosa es neutra, por lo que es una buena matriz para la electroforesis.
PERO la agarosa también es más cara porque tiene que ser purificada. Así que si no necesitas preocuparte por el tema de la carga física, ¡más vale que uses algo que tenga una carga *monetaria* más baja! Debido a que el agar requiere menos procesamiento, es más barato & perfecto para su uso como una matriz para mantener el alimento de las bacterias!.
En las placas de agar, no es el propio agar el que está proporcionando nutrientes. Esa es una de las grandes cosas sobre el agar – *la mayoría* de las bacterias no pueden comerlo. En cambio, el agar sólo proporciona un “andamiaje” para albergar los nutrientes que las bacterias necesitan. Y a menudo esos nutrientes se suministran a través de un “medio de crecimiento” alimentario bacteriano líquido llamado LB, que, a pesar de lo que digan los libros de texto, (al menos originalmente) significa caldo de lisogenia. A veces las iniciales de Luria, Lennox o Luria & Bertani se atribuyen el nombre, pero en realidad significa CALDO DE LISOGENIA y su receta fue publicada por primera vez (por Giuseppe Bertani) en 1951. La utilizaba cuando estudiaba la lisogenia (un proceso en el que un virus que infecta a las bacterias, llamado bacteriófago (“fago”), inserta su propio ADN en el ADN de una bacteria & espera su momento hasta que se den las condiciones adecuadas para entrar en el fago lítico, donde se corta a sí mismo, hace muchas copias y revienta la célula) http://bit.ly/2HLuB1S
El objetivo de LB es básicamente dar a las bacterias lo que necesitan para crecer, dividirse y hacer lo que queremos (como hacer copias del ADN que les ponemos y/o hacer copias de proteínas usando las instrucciones del ADN que les ponemos). Y hacerlo de forma barata.
Nota: Para la fabricación de proteínas y la fabricación de ADN a gran escala, cultivamos las bacterias en líquido LB directo – “en suspensión” con agitación – pero cuando necesitamos aislar grupos específicos de bacterias que se derivan de la misma “célula madre” y por lo tanto genéticamente idénticas, incrustamos ese LB en un gel para que las diferentes “colonias” genéticamente distintas no se mezclen, sino que crezcan como puntos pegajosos. Si quieres aprender más sobre varios medios para el material de suspensión echa un vistazo a este post http://bit.ly/bacterialmedia, pero hoy me voy a centrar en la forma atrapada en el gel.
No le damos a las bacterias una cocina de 5 estrellas. En cambio, queremos gastar el menor dinero posible sin dejar de darles los nutrientes que necesitan. Como mínimo, tenemos que darles una fuente de energía, algo que puedan descomponer (catabolizar) para hacer ATP – tales cosas pueden ser azúcares, proteínas, grasas. Además de descomponer las cosas, tienen que ser capaces de fabricar cosas como proteínas y ADN (hacer la parte anabólica del metabolismo). Esto requiere nutrientes que proporcionen los elementos necesarios como el carbono y el nitrógeno, que afortunadamente se pueden conseguir con una receta sencilla que es suficiente para muchas bacterias.
Hay 3 componentes principales (aunque 2 de ellos tienen a su vez muchos componentes.
- TRIPTONA -> esto es una mezcla de péptidos formados por la digestión de una proteína llamada caseína con la enzima pancreática -> esto proporciona aminoácidos que las bacterias pueden utilizar para hacer nuevas proteínas
- EXTRACTO DE LEVADURA -> este “autolisado” de levadura es básicamente sólo lo que sucedió en la levadura (compuestos orgánicos incluyendo vitaminas, oligoelementos, etc.) – y si era lo suficientemente bueno para la levadura…
- CLORURO DE SODIO (NaCl)(sal de mesa) -> permite el equilibrio osmótico, el transporte, etc.
Algunas de las principales formulaciones de LB son las versiones “Miller”, “Lennox”, &”Luria” &se diferencian en la cantidad de sal que tienen. Miller & Bertani ahogar las bacterias en NaCl (10g/L) mientras que Lennox sólo utiliza 5g/L y Luria sólo 0,5g/L -> tales recetas bajas en sal son buenas si usted está usando un antibiótico sensible a la sal. en el documento original, Bertani también añadió glucosa, pero la mayoría de las recetas posteriores lo dejan fuera.
Y hablando de dejar cosas fuera, tenemos que asegurarnos de “dejar fuera” las bacterias que no queremos, lo que podemos hacer “seleccionando” las bacterias que queremos usando medios de selección, que contienen cosas como antibióticos, etc. que suprimen el crecimiento de cosas que no quieres que crezcan. Por ejemplo, cuando introducimos genes en las bacterias, normalmente lo hacemos en forma de piezas circulares de ADN llamadas plásmidos. Diseñamos esos plásmidos para que también tengan un gen de resistencia a los antibióticos, por lo que podemos añadir al alimento ese antibiótico y todavía puede crecer, pero otras cosas no pueden http://bit.ly/2tcW4ky
También hay medios diferenciales – esto permite el “cribado” en contraposición a la “selección” – no impides que las cosas crezcan, pero cambias cómo aparecen – por ejemplo, usamos X-gal para el cribado azul-blanco http://bit.ly/2MxNPs2
Después de poner un plásmido con mi gen en las bacterias y obtener colonias, elijo algunas de esas colonias y las pongo en LB líquido (con antibiótico) para crecer durante la noche para hacer muchas copias del plásmido, entonces puedo purificar esas copias y enviarlas para la secuenciación para comprobar los errores antes de entrar en la parte de “preparación de la expresión”.
Independientemente del medio que utilices, necesitas que sea estéril. Así que lo esterilizas en autoclave (lo metes en un lavavajillas de alta presión muy caliente) -> asegúrate de que los frascos no están bien cerrados o explotarán (afortunadamente no he cometido este error) – y no vuelvas a apretar las tapas hasta que los frascos se hayan enfriado o las tapas se atascarán (yo *he* cometido este error). Otro error que no hay que cometer -> no añadir los antibióticos antes del autoclave, o los inactivarás. Nosotros no solemos añadirlo hasta justo antes de usarlo.
En la licenciatura, hice todos mis propios medios de comunicación, pero aquí, usamos tanto de ella, tenemos un técnico de laboratorio “fabricante de medios” que es increíble y hace & esterilizar nuestros medios de crecimiento bacteriano. Sabes que algo ha pasado por un autoclave si las líneas de su cinta de autoclave son negras – la cinta es sensible a la temperatura por lo que cambia de color cuando se calienta mucho. Tengo muchas ganas de diseñar una línea de cinta autoclave con mensajes de broma y/o trivialidades – así que si todo el asunto de la enseñanza no funciona, ¡supongo que tengo un respaldo!
más sobre los temas mencionados (& otros) #365DaysOfScience All (con temas listados) 👉 http://bit.ly/2OllAB0
